殼寡糖對黑豆芽營養成分及抗氧化活性的影響

蔣丹丹,王延康,唐文竹*,雷鑫亭,李憲臻

1(大連工業大學 生物工程學院,遼寧 大連,116034)2(大連醫諾生物股份有限公司,遼寧 大連,116620)

黑豆也被叫做黑大豆,是豆科大豆屬植物大豆的黑色種子,含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、纖維素和微量元素,且熱量較低,營養豐富,而且具有多種生理功能[1]。但是由于黑豆中含有植酸等抗營養因子,不僅會降低食物中營養物質的生物利用率,在一定程度上還可能會引起機體的不適[2]。發芽是一個可以有效改變黑豆營養品質的方法,研究表明,發芽過程中蛋白質、多糖和礦物質元素通過酶的活性被釋放出來,同時植酸會被分解,從而使黑豆芽中的營養成分更好地被人體吸收和利用。目前用于刺激豆類萌發的物質有:萘乙酸、6-芐基腺嘌呤、多菌靈等,但大多被認為有較低毒性[3]。因此尋找新的安全無毒豆類萌發調節劑至關重要。

殼寡糖(chitooligosaccharides,COS)一般是指2～10個氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接組成的低聚糖,具有來源廣泛、水溶性好的優點,并且容易被吸收和利用,更為重要的是其具有抗炎、增強免疫力、抗腫瘤、抑菌和抗氧化等生理活性。因此,COS在保健食品、醫療、化妝品等領域有較好的應用前景[4]。另外,在農業領域,COS既可作為病原菌抑制劑,又可以促進植物生長[5]。

目前有關COS處理對黑豆萌發后的營養成分以及抗氧化活性的影響未見報道,因此本研究探討COS浸泡處理對黑豆芽生產的促進作用,以期為改善豆芽生產中添加劑使用不合理的現象奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆,市售;COS(食品級),浙江金殼藥業有限公司;甲醇(色譜純),上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司;其余試劑均為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

InfiniteF50酶標儀,瑞士Tecan公司;恒溫恒濕培養箱,上海分析儀器制造有限公司;臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;PRIMA液相色譜儀,Hitachi公司;超級恒溫槽,上海衡平儀器儀表廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑豆芽樣品的制備

將1 500和3 000 Da的COS分別配制成0.001、0.01、0.1、1 μg/mL的溶液。精選黑豆用自來水洗凈并晾干,稱重得到初始質量,以料液比1∶8(g∶mL)分別添加不同分子質量、不同濃度的COS溶液后,置于25 ℃浸泡10 h。然后用自來水沖洗3遍后,30個黑豆一組置于鋪有濾紙的平板中,同時在黑豆上覆蓋紗布。將平板放置于恒溫恒濕培養箱中,在25 ℃、相對濕度90%條件下培養72 h,在此期間每隔12 h補水并且清洗紗布,以防止腐爛。培養結束后黑豆芽鮮樣置于4 ℃保存,取一部分鮮樣置于烘箱60 ℃烘干至恒重,粉碎后過80目篩,即為干樣。

1.3.2 黑豆芽生產性能的測定

以種子的胚根從種皮邊緣突破2 mm為發芽判定依據,每24 h記錄1次種子發芽數,并計算發芽率。

用吸水紙吸干黑豆芽表面的水分,用電子天平測量每組豆芽的總質量并計算平均值即為鮮重,單位為g。總產率為黑豆芽鮮重與原始黑豆質量的比值。

每組各挑選15個發育正常的黑豆芽,用軟尺測量豆芽胚軸頂端至胚軸根部的長度。測量后取平均值,單位為cm。然后將此部分從豆芽中分離后稱重,即為芽重,單位為g。

1.3.3 黑豆芽主要營養成分的測定

采用考馬斯亮藍G-250法[6],測定可溶性蛋白的含量。參考時寧寧等[7]的方法,測定植酸的含量。參照JAIN等[8]的方法,測定維生素C的含量。參照劉仙俊等[9]的方法對黑豆芽中的總多酚和總黃酮含量進行測定。

1.3.4 黑豆芽各組分多酚和黃酮含量的測定

使用體積分數1%甲醇鹽酸溶液提取黑豆芽干樣,離心取上清液,旋干,使用2 mL甲醇復溶,過0.22 μm有機濾膜。采用液相色譜對樣品進行檢測:ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm×5 μm),柱溫40 ℃,流速0.6 mL/min,進樣體積10.0 μL,紫外檢測波長254 nm;流動相為:(A)質量分數為0.1%甲酸溶液(B)甲醇;洗脫程序如下:0～50 min,流動相A從95%減少到70%,流動相B從5%增加到30%;50～75 min,流動相A從70%減少到0%,流動相B從30%增加到100%;75～76 min,流動相A從0%增加到95%,流動相B從100%減少到5%;76～86 min,流動相A保持95%,流動相B保持5%。

1.3.5 黑豆芽抗氧化活性的測定

參考劉仙俊等[9]的方法,分別測定黑豆芽提取液對DPPH自由基、·OH和H2O2的清除率。

1.4 數據處理

實驗所有處理均重復3次,結果表示為平均值±標準差。數據統計分析采用SPSS 25進行分析,并使用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 黑豆芽生產性能

COS作為一種激發子,可以與植物細胞上特定受體結合,激活細胞內某些酶的活性并引起信號轉導,進而激活轉錄因子,調控相關基因的表達,從而活化植物細胞的生長,調節植物生長發育狀態,提高產量[10]。本研究發現,使用COS浸泡處理黑豆后,黑豆吸水膨脹的速度加快,子葉突破種皮時間縮短,初始胚根萌發時間也明顯提前,如圖1所示,黑豆培養至24和48 h時,經過COS浸泡的黑豆發芽率明顯高于對照組,并且2種分子質量的COS,均是隨著濃度增加,處理組發芽率逐漸增加,達到0.01 μg/mL時,發芽率最高,繼續增加濃度,發芽率反而降低;而在相同濃度的條件下,分子質量較低的COS處理效果明顯好于分子質量高的COS,可能是因為其更易被細胞表面受體識別。其中,以分子質量1 500 Da、質量濃度為0.01 μg/mL的COS效果最好,24 h時發芽率為41.46%,48 h時為86.07%,分別是對照組的2.3和1.5倍。黑豆培養到72 h,盡管經過COS處理的黑豆發芽率仍高于對照組,但是各處理之間差異并不顯著。

圖1 殼寡糖對黑豆發芽率的影響Fig.1 Effects of COS on germination rate of black beans注:每個柱狀圖上不同小寫字母表示在0.05水平上有差異(P<0.05)(下同)。0為對照組;1 500-0.001為分子質量為1 500 Da,質量濃度為0.001 μg/mL的COS處理組;1 500-0.01為分子質量為1 500 Da,質量濃度為0.01 μg/mL的COS處理組;1 500-0.1為分子質量為1 500 Da,質量濃度為0.1 μg/mL的COS處理組;1 500-1為分子質量為1 500 Da,質量濃度為1 μg/mL的COS處理組;3 000-0.001為分子質量為3 000 Da,質量濃度為0.001 μg/mL的COS處理組;3 000-0.01為分子質量為3 000 Da,質量濃度為0.01 μg/mL的COS處理組;3 000-0.1為分子質量為3 000 Da,質量濃度為0.1 μg/mL的COS處理組;3 000-1為分子質量為3 000 Da,質量濃度為1 μg/mL的COS處理組(下同)。

不同處理黑豆發芽72 h后,測定了黑豆芽的鮮重、總產率以及芽長和芽重(表1)。COS處理的黑豆發芽后其鮮重、總產率及芽長和芽重均有明顯的增加。無論何種分子質量,隨著COS濃度的增加,黑豆芽各項指標均增加;當COS質量濃度達到0.01 μg/mL時,4個指標分別達到最大值,繼續增大COS的濃度,4個指標均逐漸下降。當濃度相同時,分子質量1 500 Da的COS對黑豆芽的促進效果優于分子質量3 000 Da的COS。其中,效果最好的是1 500-0.01處理組,黑豆芽鮮重、總產率及芽長和芽重分別較對照組提高了30.81%、38.50%、42.47%和41.90%。在豆芽生產中,鮮重和總產率是提升利潤的關鍵,而芽長和芽重又是評判一個豆芽品質的標準。COS在豆芽生長中可以作為非生物激活子促進黑豆的萌發,使得初始萌發時間提前,萌發更加充分,進而黑豆芽的鮮重、總產率以及芽長和芽重均表現出明顯增加。

表1 殼寡糖對黑豆芽生產性能的影響Table 1 Effects of COS on production performance of black bean sprouts

2.2 可溶性蛋白含量

黑豆蛋白質含量十分豐富,是人們獲取植物蛋白的重要來源,而在發芽過程中黑豆中的酶系會被激活而將大分子蛋白水解為小分子的可溶性蛋白等,從而更容易被人體吸收利用[11]。通過圖2可以看出,經過COS處理后的黑豆芽可溶性蛋白的含量相較于對照組均有所提高。2種分子質量的COS促進效果都隨著濃度升高而增大,到0.01 μg/mL時達到最高,濃度繼續升高,促進效果下降;而在相同濃度條件下,分子質量1 500 Da的COS效果更好。其中,分子質量為1 500 Da,質量濃度為0.01 μg/mL處理組,含量最高為86.70 mg/g鮮樣,比對照組提高了25.99%,并且經過SPSS數據分析可以看出,所有的處理組可溶性蛋白的含量都顯著高于對照組。COS在黑豆萌發過程中對可溶性蛋白的轉化合成起到一定的促進作用,這一結論也與其他人的研究一致,如狄文偉[12]使用COS噴灑黃瓜幼苗葉片,發現黃瓜中可溶性蛋白的含量最高可以提高39.29%。

圖2 殼寡糖對黑豆芽可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of COS on soluble protein content of black bean sprouts

2.3 植酸含量

植酸又被稱作肌醇六磷酸,是豆類中的主要成分之一。有研究表明植酸會與消化道中的鐵、鎂等必需礦物質結合,進而抑制人體對后者的吸收[13]。在豆類發芽過程中,其植酸酶會被激活從而將部分植酸水解為低級的肌醇磷酸,從而有效地降低豆芽中植酸的含量。由圖3可知,經過COS處理的黑豆在發芽之后植酸的含量會顯著下降,并且均低于對照組。對照組植酸含量為11 mg/(g干樣),這與李圓圓等[14]所測得數據相近。隨著COS濃度的上升,黑豆芽中的植酸含量逐漸下降,當達到0.01 μg/mL時,黑豆芽植酸含量最低,而且分子質量低的COS效果更好。其中,分子質量1 500 Da,0.01 μg/mL處理組植酸含量最低,為5.99 mg/g干樣,相比于對照組下降了45.49%。此結果遠高于郭世豪等[3]使用殼聚糖浸泡處理后黑豆芽中植酸下降的11.96%,由此可見,COS對降低黑豆芽中植酸含量的作用效果要優于殼聚糖。

圖3 殼寡糖對黑豆芽植酸含量的影響Fig.3 Effects of COS on phytic acid content of black bean sprouts

2.4 維生素C含量

維生素C在人體膠原蛋白合成過程中起著重要作用,而且人類自身無法合成維生素C,需要外源補充。豆類在萌發過程中,參與維生素C合成的酶類會被激活,從而使豆芽中的維生素C含量不斷增加。如圖4所示,經過COS處理的黑豆在發芽之后維生素C的含量均高于對照組,而且分子質量為1 500 Da的COS處理組效果較好。其中分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組維生素C含量最高,達到54.66 mg/(g鮮樣),比對照組提高了76.46%。2種分子質量的COS在質量濃度低于或者高于0.01 μg/mL時,促進效果均降低。經過SPSS數據分析,所有處理組維生素C含量都顯著高于對照組。有研究表明COS能提高植物中維生素C含量,如HE等[15]在草莓采摘前噴施COS,草莓中的維生素C含量相比于對照組提升了20.02%。

圖4 殼寡糖對黑豆芽維生素C含量的影響Fig.4 Effects of COS on soluble vitamin C content of black bean sprouts

2.5 總多酚含量

多酚類化合物是一種具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、清除體內自由基等功效的活性物質[16]。豆芽中富含天然的多酚,因此多酚含量也可以作為評判豆芽好壞的一種指標。由圖5可以看出,COS處理后的黑豆芽其總多酚含量均高于對照組,且變化趨勢與前面測定的維生素C類似。其中分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組的含量最高,為30.10 mg GAE/g 干樣,相比對照組增加了23.68%。經過SPSS數據分析,所有處理組的總多酚含量均顯著高于對照組。

圖5 殼寡糖對黑豆芽總多酚含量的影響Fig.5 Effects of COS on total polyphenols content of black bean sprouts

2.6 總黃酮含量

黃酮是有效的防癌藥物,可有效降低各種癌癥的患病風險,而種子萌發可以增加其中黃酮類化合物的含量[17]。與總多酚含量類似(圖6),經過COS處理的黑豆芽總黃酮含量均高于對照組,而且2種分子質量的COS在濃度相同的條件下作用效果類似。其中分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組效果最好,為5.94 mg/(g干樣)。經過SPSS數據分析,所有經過COS處理的黑豆芽總黃酮含量均顯著高于對照組。因此,COS可以有效提高黑豆芽中總黃酮的含量,提升黑豆芽的營養品質。TANG等[18]的研究也證明了COS可以有效地提升黃豆芽中總黃酮的含量。

圖6 殼寡糖對黑豆芽總黃酮含量的影響Fig.6 Effects of COS on total flavonoid content of black bean sprouts

2.7 各組分多酚含量

為了進一步驗證COS對黑豆芽中多酚和黃酮類物質含量的影響,選取效果最明顯的2組,即分子質量為1 500 Da,質量濃度為0.01 μg/mL的COS和分子質量為3 000 Da,質量濃度為0.01 μg/mL的COS處理黑豆后,測定黑豆芽中已知的6種多酚類和6種黃酮類化合物的含量。

選取沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和香草酸為研究對象。表2為質量濃度為0.01 μg/mL的2種分子質量COS處理后的黑豆芽中6種多酚的含量變化。經過COS處理后,6種多酚的含量相較于對照組均有顯著提高,并且分子質量小的COS處理效果更好。其中,經過1 500-0.01 COS處理后的黑豆芽原兒茶酸含量提升的最多,相比對照組提高了33.72%,其次是香草酸,提高了28.90%,沒食子酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和肉桂酸也分別提高了18.26%、28.78%、14.12%和19.50%。因此,COS在增加豆芽中的酚類次生代謝物方面非常有效,且結果與總多酚的測定結果一致。

表2 殼寡糖處理對黑豆芽中6種多酚含量的影響 單位:mg/(g干樣)Table 2 Effects of COS treatments on the concentration of six polyphenols in black bean sprouts

2.8 各組分黃酮含量

大豆異黃酮主要以兩種形式存在:苷元(染料木素、大豆苷元和黃豆黃素)和不同類型的糖苷(染料木苷、大豆苷和黃豆黃苷)。表3是質量濃度為0.01 μg/mL的2種分子質量COS處理后的黑豆芽中6種黃酮的含量變化。經過COS處理后的黑豆芽6種黃酮含量相較于對照均有所提高,并且分子質量1 500 Da的COS效果好于分子質量3 000 Da的COS,這與總黃酮含量的測定結果一致。其中1 500-0.01處理組染料木素的提升量最多,比對照組提高了27.59%,而大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元和黃豆黃素也分別比對照組提高了12.07%、7.22%、10.49%、9.87%和16.53%。實驗數據證明COS對黑豆芽中多種黃酮成分的合成也具有顯著的促進作用,并且所測得數據與PENG等[19]的結果類似。

表3 殼寡糖處理對黑豆芽中6種黃酮含量的影響 單位:mg/(g干樣)Table 3 Effects of COS treatments on the concentration of six flavonoids in black bean sprouts

2.9 DPPH自由基清除率

維生素C、多酚和黃酮作為黑豆芽中的主要的抗氧化物質,其含量在COS處理后有了明顯提高,因此推測黑豆芽的抗氧化活性可能會提高。其中,對DPPH自由基的清除能力常被用來評價物質的抗氧化能力。從圖7可以看出,經過COS處理后的黑豆芽對DPPH自由基清除率較對照組均有所提升,且影響效果與COS濃度和分子質量有關。隨著COS濃度的增加,DPPH自由基清除率表現為先上升后下降,質量濃度為0.01 μg/mL時最大,同時分子質量較小的COS處理后的黑豆芽對DPPH自由基清除率更高。其中,分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組對DPPH自由基清除率最高,達到了47.00%,而對照組對DPPH自由基清除率為34.53%,與張桂芳等[20]所做實驗結果類似。因此,COS處理可以有效提高黑豆芽對DPPH自由基清除率。

圖7 殼寡糖對黑豆芽DPPH清除率的影響Fig.7 Effects of COS on DPPH scavenging rate of black bean sprouts

2.10 ·OH清除率

·OH具有極強的氧化能力,是細胞產生的對人體健康有害的一種活性氧物質。植物中含有的維生素C、黃酮、多酚等生理活性物質對·OH有一定的清除作用[21],從圖8可以看出,經過COS處理的黑豆芽對·OH的清除率均高于對照組,且與DPPH自由基清除率變化規律一致。其中分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組·OH清除率最高,為83.58%,比對照組提高了18.43%。經過SPSS數據分析,所有處理組的清除率均顯著高于對照組。TANG等[18]的實驗也證明了COS浸泡處理黃豆,能顯著提高黃豆芽的·OH清除率。

圖8 殼寡糖對黑豆芽·OH清除率的影響Fig.8 Effects of COS on ·OH scavenging rate of black bean sprouts

2.11 H2O2清除率

H2O2是一種強氧化劑,通過檢測黑豆芽提取液對它的清除率可以很好地反映豆芽的抗氧化活性。由圖9可知,經過COS處理的黑豆發芽后對H2O2的清除率均高于對照組,并且相對于分子質量而言,COS濃度的影響較大,在相同濃度下,2種分子質量的COS的作用效果差異不大。其中分子質量為1 500 Da時,質量濃度為0.01 μg/mL處理組效果最好,為67.07%,比對照提高了14.08%。通過SPSS數據分析,所有處理組的H2O2清除率都顯著高于對照組。H2O2清除率的提升與豆芽中H2O2酶的活力有關,因此推測COS在黑豆發芽過程中會促進過氧化氫酶的合成,進而提高黑豆芽對于H2O2的清除率。

圖9 殼寡糖對黑豆芽H2O2清除率的影響Fig.9 Effects of COS on H2O2 scavenging rate of black bean sprouts

3 結論與討論

本實驗通過不同分子質量、不同濃度的COS浸泡處理黑豆后,測定了萌發的黑豆芽生長狀況、豆芽中營養成分的含量以及其抗氧化活性。研究發現,經過COS處理后的黑豆芽初始萌發時間提前,萌發更加充分,因此鮮重和總產率明顯提高,芽長和芽重也顯著增加。這與市場所需的優質豆芽條件是相吻合的,在保障質量的前提下使用COS處理的豆芽更長并且重量更大。同時COS作為功能性食品無毒,對人體安全。另外,僅僅在浸泡黑豆的過程中添加少量的COS便可起到這種作用,有利于降低工業生產中的成本。

與此同時,黑豆發芽過程中會將自身大分子營養物質在一系列酶的催化下轉化為小分子,COS在其中起到了激發子的作用。經過COS處理的黑豆芽中可溶性蛋白的含量明顯增加。同時,COS還促進了黑豆芽中植酸的消耗,因為這種抗營養因子不僅不利于人體對營養物質的利用,而且過多食用會使人腹脹氣。因此經過COS處理的黑豆芽的品質也得到了提升。此外,COS作為一種非生物激發子,會激活黑豆中某些酶活性,從而提高植物中的抗氧化物質(維生素C、黃酮和多酚)的含量,同時通過信號轉導途徑激活轉錄因子,進而提高抗氧化酶的表達水平。最終表現為黑豆芽的抗氧化活性(DPPH自由基清除率、·OH清除率和H2O2清除率)顯著提高,黑豆芽營養價值進一步提升。

綜上所述,COS在黑豆發芽過程中的使用,可以刺激黑豆萌發并提高黑豆芽產量,增加其營養物質以及降低抗營養因子的含量,同時提高其抗氧化物質含量和抗氧化活性。其中分子質量和劑量是關鍵影響因素,最終結果表明1 500 Da、質量濃度為0.01 μg/mL的COS處理效果最好。下一步將采用轉錄組學和蛋白質組學相關技術深入探討COS在黑豆芽生長和營養物質轉變過程中的作用機理,以期為COS的廣泛應用提供理論基礎。