鲊辣椒生香酵母的分離篩選鑒定及其應用研究

姚紅,尹小慶,顏宇鴿,闞建全,武運,戚晨晨,王治國,Sameh AWAD,Amel IBRAHIM,杜木英*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(中匈食品科學合作研究中心,重慶,400715)3(川渝共建特色食品重慶重點實驗室,重慶,400715)4(西藏自治區農牧科學院農產品開發與食品科學研究所,西藏 拉薩,850030)5(新疆農業大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830052)6(新疆新康農業發展有限公司,新疆 烏魯木齊,830022)7(亞歷山大大學 農學院,埃及 亞歷山大,21532)

鲊辣椒通常以鮮紅椒和玉米粉為原料,輔以食鹽、生姜、大蒜等香辛料自然發酵而成。作為中國南方的一種特色發酵食品,因其酸辣爽口、色澤鮮艷而受到大眾的歡迎[1],目前傳統鲊辣椒的生產以小作坊為主,鲊辣椒發酵過程有著諸多不確定因素,導致產品風味品質不穩定,限制鲊辣椒工業化生產[2]。

復雜的微生物群落對鲊辣椒的風味品質產生有著關鍵性作用[3]。目前,對鲊辣椒的研究主要集中在菌株的分離鑒定[4]、鲊辣椒細菌多樣性[5-6]以及產品的工藝優化等方面,關于純菌種和菌種復配發酵鲊辣椒的研究鮮有報道。生香酵母作為一類以代謝生成酯類物質為主,同時能促進醇、酮、醛、酚等揮發性風味物質產生的微生物,對于發酵產品的風味品質的提升有著重要作用。李澤洋等[7]從米酒中篩選出一株產香能力突出的酵母豐富了米酒香氣,促進了酒體風格的形成。李夢雅等[8]通過嗅覺評定和總酯產量測定,從辣椒醬中獲得了一株耐鹽且生香能力強的魯氏酵母(Saccharomycesrouxii),該酵母產生了多種呈蜜香和果香的揮發性風味成分,顯著提升了辣椒醬的香氣。本實驗室前期對不同產地鲊辣椒風味以及鲊辣椒發酵過程中微生物群落結構演替等進行了探究[9-10],但混合菌種對發酵鲊辣椒風味品質提升的研究尚未涉及,因此本試驗繼續研究生香酵母對鲊辣椒風味品質的影響。

本文擬從自然發酵鲊辣椒中分離篩選出優良產香菌株,對比自然發酵鲊辣椒、純種發酵及混菌發酵鲊辣椒中基本理化指標、有機酸、辣椒堿及揮發性風味物質,評價生香酵母對鲊辣椒風味品質提升作用,考察生香酵母在鲊辣椒生產的可行性,滿足市場對辣椒產品的多樣化需求,為傳統鲊辣椒生產與現代生產工藝相結合奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅辣椒、生玉米粉、腌制鹽,重慶北碚永輝超市。

植物乳桿菌XZ3:實驗室前期從自然發酵鲊辣椒中篩選所得,保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),保藏編號為CGMCC No.22959。

自然發酵鲊辣椒:25 g新鮮紅辣椒(經過料理機破碎,大小均勻,不超過2 mm×2 mm)、25 g生玉米粉、2 g腌制鹽, 30 ℃恒溫發酵4 d。

鲊辣椒基料培養基:25 g新鮮紅辣椒(經過料理機破碎,大小均勻,不超過2 mm×2 mm)、25 g生玉米粉、2 g腌制鹽。

有機酸、辣椒素、二氫辣椒素標準品、色譜級甲醇,上海阿拉丁生化股份有限公司;其他實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BX53熒光正置顯微鏡,日本OLYMPUS公司;WZT-1M細菌濁度儀,上海勁佳科學儀器有限公司;Thermal Cycler 2720型PCR儀,美國應用生物系統公司;100 μm PDMS固相微萃取裝置,美國Supleco公司;GCMS-2010氣相色譜質譜聯用儀、LC-20高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生香酵母的分離與純化

取1.0 g自然發酵鲊辣椒于30 mL無菌水中,充分振蕩混勻后對其進行10倍梯度稀釋,各吸取0.1 mL于YPD固體平板培養基,30 ℃恒溫培養24 h。通過觀察選取疑似酵母菌的菌落鏡檢,將符合酵母形態描述的菌株接種于WL營養瓊脂培養基,30 ℃恒溫培養3 d,根據WL培養基變色情況挑取不同的酵母菌落[11],于熒光正置顯微鏡下觀察。挑起少許不同形態單菌落溶于10 mL無菌水中,吸取0.1 mL涂布接種于YPD平板培養基上,在30 ℃下培養48 h用平板劃線法轉接2～3次,直至得到單菌落并將其編號保藏。

1.3.2 生香酵母的篩選

取2 mL分離純化的酵母菌菌液(107CFU/mL)分別接種到100 mL YPD液體培養基中,不接菌作空白對照,置于30 ℃恒溫培養箱中,150 r/min振蕩培養24 h。采用嗅聞法[12]對發酵液進行感官評定,舍棄產香能力弱及產異味的菌株。將篩選出來的酵母添加到鲊辣椒基料培養基中進行發酵,并采用回流皂化法[13]測定其總酯含量。

1.3.3 生香酵母的鑒定

DNA提取:取適量菌體,加入CTAB提取液800 μL研磨至離心管。65 ℃水浴35 min,加入800 μLV(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1,充分搖勻靜置15 min后,12 000 r/min離心10 min。轉移至離心管內加入1 mL 95%冰凍乙醇,-20 ℃冷凍0.5 h以上,再次離心,加入1 mL 70%乙醇,靜置5 min,再重復上述操作。于超凈工作臺中干燥,重新溶于50 μL Trist EDTA(TE)緩沖液中。

PCR擴增:使用酵母菌的通用引物(NL1:5′-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3′,NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行PCR擴增。反應體系:10×Buffer 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 5 mmol/L NL1和NL4各0.8 μL,0.2 μL rTaq聚合酶,0.2 μL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,補ddH2O至20 μL。

反應條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35次循環,最后72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。

產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,進行擴增條帶的分離。測序由天一輝遠公司在NCBI上進行BLAST search的分析,采用26S rDNA進行鑒定,并用MEGA軟件構建系統發育樹。

1.3.4 發酵液的制備

植物乳桿菌XZ3發酵液:無菌條件下移取植物乳桿菌菌液0.5 mL于2 mL MRS肉湯培養基,37 ℃恒溫厭氧培養24 h,經過2次活化,于8 000 r/min冷凍離心10 min,并洗滌3次,調節濃度至1.00 MCF(約為3×108CFU/mL)。

生香酵母發酵液的制備:用接種針挑取適量酵母菌種到10 mL YPD肉湯培養基中,在30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養24 h,冷凍離心10 min,并洗滌3次,通過血球計數板計數將濃度調節為107CFU/mL。

1.3.5 鲊辣椒的制備

將新鮮紅辣椒摘除蒂柄,清水沖洗3次,在自然通風處晾干,用料理機破碎(大小不超過2 mm×2 mm)。加入紅辣椒等量的生玉米粉,4%的食鹽(以紅辣椒和玉米粉的總質量計)、少量的水,以捏可成團松即散開為宜。將其裝入罐內不蓋嚴,30 ℃下自然發酵6 d,得鲊辣椒A;將2.5%植物乳桿菌XZ3發酵液均勻接入拌好的基料培養基中,其余步驟均相同,得鲊辣椒B;將植物乳桿菌XZ3和生香酵母菌Y50的菌體發酵液按1∶1的比例混勻,然后按2.5%的接種量將此混合發酵液接入拌好的基料中,其余步驟均相同,得鲊辣椒C。

1.3.6 鲊辣椒理化指標的測定

1.3.6.1 pH值測定

參照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》測定。

1.3.6.2 總酸含量測定

參照鄭莎莎等[14]的方法,稱取5.0 g鲊辣椒于100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混合均勻后過濾。量取10 mL上清液于燒杯中,加60 mL蒸餾水,將燒杯放置于磁力攪拌器上。用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 8.2,記錄此時消耗堿液體積V1(mL),同時做空白試驗得到V0(mL)。按公式(1)計算:

(1)

式中:m,稱取的鲊辣椒質量,g;K,酸的換算系數,以乳酸計為0.090。

1.3.6.3 亞硝酸鹽的測定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法進行測定。

1.3.6.4 還原糖的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15]。

1.3.6.5 維生素C的測定

維生素C含量采用2,6-二氯靛酚測定[16]。

1.3.6.6 類胡蘿卜素含量的測定

稱取0.5 g鲊辣椒樣品,加入一定量的丙酮溶液在研缽中反復研磨至無色,濾紙過濾,將濾液用丙酮溶液定容至50 mL。以丙酮溶液作空白對照,分別在663、646、470 nm波長處測定提取液的吸光度[17],計算類胡蘿卜素含量。

1.3.7 鲊辣椒有機酸含量的測定

樣品前處理:稱取1.0 g樣品,加40 mL純水于水浴中超聲波處理30 min后,定容到50 mL,雙層濾紙過濾。取20 mL濾液,分別加入30% ZnSO4溶液和10.6% K4Fe(CN)6溶液各1 mL[18],搖勻,靜置30 min后再次用雙層濾紙過濾,濾液經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。

GC條件:使用Thermo C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱;流動相為V(0.1%磷酸水溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5;流速0.7 mL/min;進樣量20 μL;柱溫28 ℃;檢測波長210 nm。采用保留時間定性,以峰面積外標法定量。

1.3.8 鲊辣椒辣椒堿含量的測定

參照GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質測定及辣度表示方法》,將辣椒堿混合標準液經0.45 μm濾膜過濾后上機分析。

GC條件:色譜柱Thermo C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);進樣量20 μL;流動相為V(甲醇)∶V(水)=80∶20;流速0.8 mL/min;柱溫40 ℃;檢測波長281 nm。采用外標法對鲊辣椒中的辣椒素及二氫辣椒素進行定量。

1.3.9 鲊辣椒揮發性成分的測定

稱5.0 g鲊辣椒加入5 mL的0.1 g/mL NaCl溶液和10 μL的300 mg/L正癸烷作為內標。在55 ℃恒溫水浴平衡30 min,萃取頭頂空吸附40 min進樣。

GC條件:DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:柱溫箱起始溫度40 ℃,保持3 min,10 ℃/min升溫到100 ℃,1 ℃/min升溫到115 ℃,3 ℃/min升溫到160 ℃,最后以10 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min;柱流量1 mL/min;進樣口溫度250 ℃;不分流進樣。

MS條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,電子能量70 eV;接口溫度250 ℃;離子源溫度250 ℃;溶劑延遲3 min;質量掃描范圍40～400m/z。采用NIST17-1譜庫檢索,相似度>80%,結合保留指數進行定性,內標法定量。

1.3.10 特征香氣成分分析

鲊辣椒香氣由多種揮發性成分構成,只有該成分的濃度大于其閾值才能被人感知。香氣活度值(odor activity value,OAV)是表征揮發性物質含量及其閾值的概念[19],當揮發性物質的OAV>1時,認為該組分為鲊辣椒的特征香氣成分,OAV越大對鲊辣椒總體風味貢獻就越大[20]。OAV按公式(2)計算:

(2)

式中:Ci,揮發性成分的含量,μg/kg;Ti,揮發性成分的閾值,μg/kg。

1.4 數據分析與處理

每個實驗重復3次,結果表示為平均值±標準差。使用Origin 2018作圖,SPSS 25.0進行統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態特征

經過平板分離和熒光正置顯微鏡檢查,結合WL篩選培養基顏色變化從鲊辣椒中共篩得9株酵母,編號分別為Y3、Y11、Y19、Y20、Y21、Y26、Y28、Y32、Y50。其中Y3菌落乳白色,大而厚不透明,表面有精致的紋狀條紋,中部隆起。Y11、Y19、Y21、Y26、Y32菌落乳白色,大而厚不透明,表面光滑有反光至暗淡,菌落圓形隆起,外圍平坦成帽緣狀。Y20、Y50菌落乳白色,表面光滑,菌落圓形隆起至菌落中央隆起,外圍平坦。

如圖1所示,Y3細胞呈卵圓形,一端出芽生殖。Y11、Y50細胞呈臘腸形,出芽后的子細胞與母細胞之間形成了有分枝的短鏈。Y19酵母細胞近球形,兩端出芽生殖。Y20、Y21、Y26細胞呈寬橢圓形,一端出芽生殖。Y28細胞近梭狀或呈卵圓形,一端出芽生殖。Y32細胞呈橢球或近球形,一端出芽生殖。

圖1 酵母細胞形態(×100)Fig.1 Yeast cell morphology(×100)

2.1.2 生香酵母的篩選

從鲊辣椒中初步分離純化得到了9株酵母菌株,其香氣評價和總酯含量見表1。總酯含量最高的為菌株Y50,達37.7 mg/g,香氣強烈,呈現花香、果香和醇香的香氣特征,故后續對Y50進行菌株鑒定及混菌發酵鲊辣椒試驗。

表1 篩選菌株產酯情況和香氣評價Table 1 Screening strain ester production and aroma evaluation

2.1.3 26S rDNA測序及系統發育分析

如圖2所示,Y50和Pichiakudriavzevii的親緣關系最近,且在NCBI上獲得了基因庫登錄號(MH443764.1),由此確定Y50為庫德里阿茲威氏畢赤酵母。該菌株寄送至CGMCC保藏,保藏編號為CGMCC No.21173。

a-26S rDNA凝膠電泳圖;b-系統發育樹圖圖2 Y50酵母26S rDNA凝膠電泳圖和系統發育樹Fig.2 26S rDNA gel electrophoresis diagram and phylogenetic tree of Y50

2.2 鲊辣椒基本理化指標分析

鲊辣椒的基本理化指標反映其營養安全等品質特征。如表2所示,鲊辣椒B和鲊辣椒C的pH值和總酸含量無顯著性差異(P>0.05),但pH值顯著低于鲊辣椒A,而總酸含量顯著高于鲊辣椒A(P<0.05)。過量的亞硝酸鹽與食物中的生物胺相互作用,進而轉化為亞硝胺對人體造成危害[21-22]。3種鲊辣椒亞硝酸鹽的含量無顯著差異(P<0.05),均低于4 mg/kg,符合辣椒制品的國家標準。3種鲊辣椒還原糖含量差異性顯著(P<0.05),鲊辣椒C中還原糖的含量最低,可能是由于微生物對糖類的利用率不同導致。鲊辣椒C中類胡蘿卜素含量顯著高于鲊辣椒A和鲊辣椒B,但含量僅僅高出0.03 mg/g,而維生素C的含量則與鲊辣椒A無顯著性差異,但顯著低于鲊辣椒B。

表2 三種鲊辣椒的基本理化指標Table 2 Basic physical and chemical indexes of three kinds of Zha-chili

2.3 鲊辣椒中辣椒堿含量分析

辣椒素類物質決定了鲊辣椒的辣味,且具有多種生理功能,除了能夠起到降血壓、降膽固醇、預防心臟病和良好的抗癌能力外[23],最新研究還表明辣椒素具有潛在的皮膚病學應用前景,可作為治療色素沉著過度的安全藥物[24]。由表3可知,鲊辣椒C中辣椒堿的總含量最高,為(0.43±0.02) mg/g,與鲊辣椒A中辣椒堿總含量差異并不顯著(P>0.05),但顯著高于鲊辣椒B中辣椒堿的總含量(P<0.05)。

2.4 鲊辣椒有機酸的含量分析

有機酸不僅能賦予鲊辣椒豐富的酸味,促進食物中Cu、Ga和Zn的溶解代謝,提高人體吸收K的能力,還能增強人的食欲和免疫力。如表4所示,鲊辣椒C和鲊辣椒B中有機酸含量顯著高于自然發酵的鲊辣椒A(P<0.05),這與王曉飛[25]研究中接種發酵泡菜的有機酸含量比自然發酵的泡菜更高相一致。鲊辣椒C有機酸含量達(25.46±0.32) g/kg,比鲊辣椒A和鲊辣椒B分別高出57.8%和32.2%。其酒石酸、甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的含量均高于鲊辣椒A和鲊辣椒B。檸檬酸具有清涼感的酸味,能降低胃腸道內容物的pH,促進食物中營養成分的分解,有助于腸道對礦物質的吸收。乙酸的酸味有刺激性,但能被蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸中和,酸味變得更加柔和、醇厚[26]。琥珀酸有豆醬類的風味,其含量在鲊辣椒C中最高。可見添加生香酵母的鲊辣椒C顯著提高了有機酸的含量,酸味特征明顯,滋味更加豐富,潛在的營養功效最大。

表4 三種鲊辣椒中有機酸含量 單位:g/kgTable 4 Organic acid content in three kinds of Zha-chili

2.5 鲊辣椒揮發性風味成分分析

由圖3-a可知,3種鲊辣椒共檢出131種香氣成分,其中酯類有57種、醇類26種、烯類、醛類、酸、酮類、酚類各為12、10、12、8、4種,但共有的揮發性成分只有36種,可見3種鲊辣椒的風味物質有較大的差異。

a-揮發性物質數量;b-揮發性物質含量圖3 三種鲊辣椒揮發性成分種類數量及含量Fig.3 Volatile components species, quantity and content in three kinds of Zha-chili

在這3種鲊辣椒中,所檢出的酯類物質種類最多,這可能是由于乳酸菌的厭氧發酵產生的酸類與醇類物質發生酯化反應生成[27],鲊辣椒A和C中酯類物質種類分別為39和32種,有15種酯類物質被同時檢出,包括乙酸己酯、水楊酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等,賦予了鲊辣椒果香、花香、蜜香等香氣特征[28]。主要來源于氨基酸代謝[29]的支鏈酸酯3-甲基丁酸-4-甲基戊酯是3種鲊辣椒中含量最高的酯類物質。鲊辣椒C中酯類物質的含量是鲊辣椒B中的2.02倍,說明添加生香酵母提升了只接種植物乳桿菌鲊辣椒的香氣,影響著鲊辣椒的香氣特征和香氣的豐富度。

醇類物質的產生主要依賴于微生物活動以及氨基酸降解作用[30],3種鲊辣椒中的共有醇類物質有8種,其中苯乙醇含量最高,賦予鲊辣椒玫瑰香味。鲊辣椒C中含量最高且特有的異戊醇賦予鲊辣椒辛辣的味道。由圖3-b可知,萜烯類物質是含量僅次于酯類的香氣物質,對鲊辣椒的香味貢獻較大,其含量分別占了其總揮發性物質的29%、34%和7%。β-石竹烯、(+)-檸檬烯和(-)-β-花柏烯為3種鲊辣椒共有的烯類香氣物質。醛類具有濃烈的花香、果香[9,31],在3種鲊辣椒中種類相差不大,含量均較少,但是鲊辣椒C中醛類物質的含量分別是鲊辣椒A和鲊辣椒B的2.06倍和1.68倍。β-紫羅蘭酮為3種鲊辣椒中共有的酮類物質,且其香氣閾值僅0.007 μg/kg,對鲊辣椒樣品整體香氣貢獻極大。酚類共檢出4種,其中愈創木酚帶有水果香、花香、焦醬香、甜香和青草香,4-乙基苯酚僅在鲊辣椒A中檢出。

鲊辣椒A共檢出90種揮發性風味物質,其總量為(7 575.51±46.71) μg/kg,鲊辣椒B共檢出67種揮發性風味物質,其總量為(8 703.92±118.44) μg/kg,而鲊辣椒C共檢出72種揮發性風味物質,其總量為(10 101.11±99.04) μg/kg。雖然鲊辣椒A的揮發性物質的種類最多,但鲊辣椒C揮發性物質的含量比鲊辣椒A和鲊辣椒B分別高33%和16%,其中酯類、醇類、醛類、酸類揮發性物質均有提高,相比鲊辣椒A分別提升了75%、358%、106%和23%,相比于鲊辣椒B分別提升了102%、59%、68%和51%,說明添加生香酵母Y50能提升鲊辣椒的整體的風味。

2.6 香氣活度值分析

通過對鲊辣椒揮發性物質的含量和感官閾值OAV表征可以對其各香氣成分的貢獻進行綜合評價,并且認為OAV>1的香氣成分對其影響顯著。根據公式計算,3種鲊辣椒中共檢出22種OAV>1的香氣化合物,如表5所示,其中酯類、醇類、烯類、醛類、酮類以及酚類化合物分別為8、6、2、3、1、2種。

表5 三種鲊辣椒中主要成分的OAVTable 5 The OAVs of major compounds in three kinds of Zha-chili

β-紫羅蘭酮為3種鲊辣椒中共有的酮類化合物,由于其閾值較低,對鲊辣椒樣品整體香氣貢獻很大。2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、正庚醇、(+)-檸檬烯、庚醛、愈創木酚的OAV均大于10,可以推測這些化合物對鲊辣椒C的香氣的產生具有很大貢獻。

3 結論

從自然發酵鲊辣椒中分離篩選到1株生香酵母Y50,經鑒定為庫德里阿茲威氏畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。對比了自然發酵鲊辣椒,利用植物乳桿菌XZ3純種發酵鲊辣椒和Y50與XZ3混菌發酵3種鲊辣椒基本理化指標、辣椒堿、有機酸、揮發性成分,并評價了Y50發酵鲊辣椒風味品質特征。結果表明,篩選得到的生香酵母Y50與植物乳桿菌混合發酵的鲊辣椒對比其他2種鲊辣椒擁有更高的辣椒素含量,更加豐富的有機酸以及更高的揮發性成分含量,其中酯類、醇類、醛類、酸類揮發性物質均有提高。香氣活度值的計算結果表明,β-紫羅蘭酮、2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、正庚醇、(+)-檸檬烯、庚醛、愈創木酚是構成鲊辣椒C風味的關鍵物質,形成了鲊辣椒C的特征風味。試驗表明,Y50對鲊辣椒風味品質有良好的提升作用,具有進一步應用于實踐生產的潛力。