高溫大曲中大曲巖石芽孢桿菌的篩選及其特性分析

孫佳,杜海*,徐巖*

1(江南大學 釀造微生物與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

近年來,發酵食品受到廣泛的歡迎,在各國菜肴中占有重要的地位[1]。發酵食品采用自然接種、天然發酵的工藝,具有獨特的風味特征。白酒是一種典型的多菌種固態發酵食品,風味是衡量白酒品質的重要指標[2]。醬香型白酒是中國三大傳統白酒之一,因其獨特的風味而廣受喜愛。醬香型白酒具有濃郁持久的香氣,無論是香味化合物的種類還是含量都遠高于其他香型白酒[3]。醬香型白酒的風格源于其獨特的釀造工藝和發酵特點[4]。醬香型白酒的釀造采用高溫大曲, 高溫大曲含有多種微生物和酶類,在賦予醬香型白酒典型特征香氣和口味方面起著重要作用。

高溫大曲生產過程中的培養溫度為60 ℃以上,遠高于其他大曲[5]。高溫大曲在堆積發酵結束拆倉時會形成不同顏色的曲塊,分為白曲、黃曲和黑曲[6]。溫度是影響高溫大曲發酵過程中微生物群落組裝和風味代謝的關鍵環境因素之一[7-8]。芽孢桿菌為多種類型大曲中最具代表性和具有耐高溫特性的細菌之一,被證明是醬香型白酒生產中主要的產醬香風味功能性細菌,在白酒的發酵過程中,可以水解蛋白質和淀粉等大分子物質,并代謝生成多種風味化合物,其對于白酒的風味貢獻已被廣泛研究[9-11]。

除了研究較多的芽孢桿菌外,其他微生物的潛在功能也需要探索。大曲巖石芽孢桿菌(Scopulibacillusdaqui)最早是從芝麻香型白酒制作過程中采集的高溫大曲樣品中分離出來的一株嗜熱菌[12],與其相關的研究報道非常少。本研究使用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用技術(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和高通量測序技術,同時運用相關性分析的手段,解析了火山渣芽孢桿菌屬(Scopulibacillus)與大曲風味物質的關聯程度。并以高溫大曲黑曲樣本為篩菌對象,采取合適的分離篩選辦法,對高溫大曲中的火山渣芽孢桿菌屬微生物進行分離,研究其對在不同溫度下(30、40、50、60 ℃)的生長特性和產風味情況。本研究有助于高溫大曲中嗜熱微生物的研究,并為其在制曲工藝中的生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

高溫大曲樣本,貴州省某酒廠,選取黃白黑3種不同類型的大曲樣本各3塊作為平行采集樣本,詳細信息見表1。將曲磨成細粉,確保每個樣品的質量有200 g,放入自封袋中及時轉移至-80 ℃冰箱保存。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

1.2 主要試劑與儀器

乙醇、三氯甲烷、酵母粉、瓊脂粉、蛋白胨,國藥集團化學試劑(北京)有限公司;飽和酚溶液,生工生物工程(上海)股份有限公司。

GC 7890B氣相色譜/MS 5975質譜、色譜柱DB-FFAP,美國Agilent公司;SPME自動進樣系統,德國Gerstel公司;三相萃取頭,上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 核酸提取、測序及生物學分析

為了確定大曲中的微生物群落結構,提取大曲的DNA后進行高通量測序。DNA提取具體實驗步驟參考ZHANG等[13]的方法。提取到的總DNA測定其濃度后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將質量濃度>50 ng/μL,且具有清晰條帶的DNA樣本置于-80 ℃冰箱保存備用。細菌使用通用引物組338F和806R擴增16S rRNA基因的V3～V4高變區。真菌使用通用引物組ITS3和ITS4擴增內部轉錄間隔區(ITS2)區域。測序工作由南京基序智谷生物科技有限公司(中國南京)完成。生成的所有原始序列均通過QIIME v.1.9.1和R(http://www.r-project.org)進行處理。使用Greengene_16S rRNA數據庫和基于QIIME的RDP分類器包裝器(v.2.2),對代表性的細菌OTU序列進行注釋。使用BLAST將代表性真菌OTU序列與UNITE真菌ITS數據庫(https://unite.ut.ee/)進行比較。

1.4 風味物質的測定

將大曲粉(5 g)添加到20 mL超純水中,超聲波處理30 min(0 ℃),4 ℃冰箱過夜放置后8 000×g離心10 min(4 ℃),收集上清液備用。在20 mL頂空樣品瓶中依次加入5 mL上清液以及1.5 g NaCl,再以5 μL薄荷醇(質量濃度為100 mg/L)作為內標,迅速用帶聚四氟乙烯墊片的空心鐵蓋密封。檢測條件參照本實驗室前期建立的方法[14]。

1.5 菌株的篩選及形態學觀察

稱取10 g高溫大曲黑曲樣品,加入90 g滅菌后的0.9%生理鹽水和2～3顆玻璃珠,放置于50 ℃培養箱振蕩30 min。涂布適宜稀釋梯度的菌懸液于LB平板,重復操作3次后置于50 ℃培養箱培養36 h,根據不同菌落形態進行類編號和形態學觀察。

1.6 菌株的分子生物學鑒定

使用Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒提取待測菌株的DNA。以細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增。PCR反應條件:94 ℃預變性6 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30個循環,72 ℃延伸10 min。測定濃度后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。將符合條件的DNA樣本送至上海生物工程有限公司進行測序。測序結果在美國國家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數據庫中進行BLAST比對,用MEGA 11.0構建目標菌的系統發育樹。

1.7 菌株的生長特性研究

將分離篩選出的菌株接種于小麥汁培養基中,分別于30、40、50、60 ℃,200 r/min搖床培養,每隔3 h取一次樣,并于600 nm處測其OD值。

1.8 菌株的固態發酵風味成分分析

小麥固體發酵培養基:破碎后的小麥為原料,加入95 ℃的水(50%)潤糧5 h,115 ℃滅菌30 min,無菌條件下按200 U/g淀粉加入糖化酶,60 ℃處理2 h,裝瓶115 ℃滅菌30 min備用。將菌株接種于LB液體培養基,50 ℃搖床培養24 h即為種子液。將種子液按10%的接種量添加至100 g的小麥固體發酵培養基中,分別置于30、40、50、60 ℃ 4個不同溫度下的培養箱中靜置發酵7 d。采用HS-SPME-GC-MS分析檢測菌株在不同溫度下發酵產物的揮發性風味物質。具體操作參考1.4節的方法。

1.9 數據分析及繪圖

利用SIMCA-14.1軟件對揮發性風味進行多元統計分析;使用RFRUSPSS統計軟件計算出Spearman相關系數,顯著性水平設定在0.05,利用Gephi繪制網絡圖;生長曲線及風味變化繪圖采用Origin 2022。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲中的揮發性組分分析

通過HS-SPME-GC-MS分析,在黃白黑3種高溫大曲樣本中共鑒別出135種揮發性化合物,共計12類(表2)。其中定性出的數量最多的是含氮化合物、醇類和酯類化合物,均定性出23種,共占據全部組分的51.11%。并非所有揮發性成分都具有一定的香氣屬性,將定性出的135種揮發性化合物與Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)兩個香氣數據庫進行比對,結果顯示共有78種化合物具有香氣貢獻,其相對含量如增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。

表2 三種類型大曲中鑒定的揮發性化合物Table 2 Volatile compounds identified in three kinds of Daqu

采用偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)模型法,對不同樣本間的78種香氣化合物進行關聯分析。如圖1所示,9個高溫大曲樣品根據黃白黑3種不同類型聚為3類,表明黃白黑3種不同類型的大曲之間的代謝物具有顯著差異。如電子增強出版附表1所示,含氮化合物中2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪在黃曲和黑曲中的含量明顯高于白曲。YANG等[15]基于全二維氣相色譜-飛行時間質譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography and time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF/MS)和超高效液相色譜與串聯四極桿飛行時間質譜儀聯用(ultra performance liquid chromatography with tandem quadrupole time of flight mass spectrometer,UPLC-Q-TOF/MS)從高溫大曲3種不同類型的大曲中共檢測出647種化合物,其中黑曲和黃曲中的吡嗪結構多樣,如2,6-二甲基吡嗪僅存在于黑曲和黃曲。WANG等[16]的研究表明在高溫環境下,嗜熱微生物(如芽孢桿菌)可以產生吡嗪,成為占主導地位的微生物群落,說明黑曲和黃曲的發酵溫度可能更高。因此,3種大曲中化合物的組成和含量差異顯著,可能是由于發酵室不同區域溫度差異引起的菌群差異所導致的。

圖1 三種類型大曲的PLS-DA評分圖Fig.1 PLS-DA score plot of three kinds of Daqu

2.2 高溫大曲微生物群落結構分析

為了揭示高溫大曲黃白黑樣品中菌群結構的差異,對細菌和真菌屬水平進行了分析。高通量結果顯示所有樣品中共檢測到108個細菌屬和22個真菌屬。本研究將相對豐度>1%的屬定義為優勢屬,其分布情況如圖2所示。

a-細菌;b-真菌圖2 三種類型大曲的微生物群落屬水平結構Fig.2 Microbial community structure at the genus level of three kinds of Daqu

對于真菌屬,Thermoacus和Thermomyces在所有樣品中均占有極高的豐度,其平均相對豐度分別為49.8%和41.9%。對于細菌屬,細菌群落主要由3種優勢細菌屬組成:Virgibacillus、Kroppenstedtia、Scopulibacillus,其平均相對豐度分別為34.9%、29.3%、11.2%。ZHU等[17]研究了高溫大曲發酵過程微生物多樣性的動態變化規律,結果表明Kroppenstedtia、Bacillus、Virgibacillus、Thermoascus和Thermomyces為高溫大曲發酵終點的標志性微生物。此外,已有研究揭示了Scopulibacillus是高溫大曲的代表性細菌群之一[18],在我們的研究中Scopulibacillus隨大曲顏色的加深而明顯增多(白曲1.4%,黃曲8.7%,黑曲23.7%)。這很可能是由于其作為一種嗜熱菌屬,相對于白曲,黃曲和黑曲的發酵溫度更高,因而更有利于其生長繁殖。

2.3 微生物群落與風味物質的關聯分析

網絡關聯分析是研究微生物和風味化合物之間潛在相互作用的有力工具。為了加強黃白黑大曲樣本之間的分離,進行了PLS-DA。通過變量投影重要性指標(variable importance in projection,VIP)值來判別對于區分黃白黑3種大曲具有一定貢獻的差異微生物和風味化合物,其中共有5種微生物和28種香氣化合物VIP值>1。因此計算了5種差異微生物與28種差異化合物之間的Spearman相關系數,并選取ρ>0.5和顯著性P<0.05的關系作為網絡的強相關節點(圖3)。分析結果顯示,3個細菌屬與2個真菌屬與20種風味化合物呈顯著正相關性(P<0.05,ρ>0.5)。其中,Scopulibacillus與6種風味化合物顯著正相關(P<0.05,ρ>0.5)。參考香氣數據庫,這6種風味化合物大多都有怡人的芳香氣味,如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪(炸馬鈴薯)、3-羥基-2-丁酮(奶油味)、鄰苯二甲醚(香草味)、正己醇(花香味)和苯乙醇(蜂蜜味)。SHI等[18]研究結果顯示包含Scopulibacillus在內的4個細菌屬和2個真菌屬幾乎與高溫大曲所有豐富的揮發物都表現出正相關。這些結果表明Scopulibacillus可能是高溫大曲中重要的風味功能微生物。

圖3 微生物與揮發性物質之間的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between microbiota and volatile compounds

2.4 菌株的分離篩選及形態學特征

利用平板涂布分離方法,對能夠在50 ℃的高溫條件下存活的菌株進行多次分離純化。最終得到1株純種菌株LBM32026。其在LB固體培養基上的菌落形態和革蘭氏染色鏡檢結果如圖4所示。

a-菌落形態圖;b-顯微形態圖圖4 菌株LBM32026的形態學特征Fig.4 Morphological characteristics of strain LBM32026

2.5 菌株的分子生物學鑒定

以目標菌株的DNA為模板,經PCR擴增出的16S rDNA序列大小為1 443 bp。從系統樹可知,LBM32026與大曲巖石芽孢桿菌親緣關系最近。通過序列與NCBI數據庫對比發現菌株LBM32026與Scopulibacillusdaqui(KC913194.1)相似性為99.79%。由此可確定這株菌為Scopulibacillusdaqui,其系統發育樹如圖5所示。

圖5 菌株LBM32026系統發育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of strain LBM32026

2.6 菌株的生長特性研究

由圖6可知,該菌株在50和60 ℃的高溫條件下培養9 h后逐漸進入對數期,15 h時OD600達到最大,此后菌株生長較為平緩,進入穩定期。而在30 ℃和40 ℃的低溫條件下,菌株幾乎不生長。即該菌株在50 ℃和60 ℃條件下生長較為迅速,在30 ℃和40 ℃條件下生長速度變慢甚至出現抑制生長的現象。

圖6 菌株LBM32026在不同溫度下的生長曲線Fig.6 Growth curve of strain LBM32026 at different temperatures

2.7 菌株的固態發酵風味成分分析

為了進一步確定ScopulibacillusdaquiLBM32026產生的揮發性化合物,采用HS-SPME-GC-MS分析檢測耐高溫菌株在30、40、50、60 ℃ 4個不同溫度下發酵7 d的發酵產物,共發現揮發性化合物40種。其中包括8種醇類、2種酯類、3種酸類、8種含氮類、7種芳香族、4種酚類、5種醛類、1種酮類、1種內酯類和1種其他類化合物,其半定量計算結果見增強出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。經對比在原位體系中6種與Scopulibacillus顯著正相關的風味化合物也均被檢測到,其中2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪僅在50、60 ℃中被檢測出,這表明高溫更有利于這類物質的產生。3-羥基-2-丁酮的含量呈先升高后下降的趨勢,在發酵體系中其可以作為四甲基吡嗪合成的前體物質。鄰苯二甲醚僅在40 ℃下微量檢出。正己醇和苯乙醇的含量隨著發酵溫度的升高整體呈下降趨勢。

隨著溫度的升高,菌株固態發酵產物揮發性成分整體含量、含氮化合物、酚類、醛類、內酯類和酸類化合物含量呈上升趨勢。含氮化合物主要是吡嗪類,是美拉德反應的產物之一[19]。吡嗪類化合物一般具有烘焙香和堅果香味,對高溫大曲曲香的形成具有重要貢獻[20]。菌株還可以代謝生成愈創木酚,相對含量占總揮發性化合物的20%以上,愈創木酚具有煙熏風味,是醬香型白酒中主要的酚類物質。醛類化合物通常表現為水果香味,是大曲和白酒中的重要呈香物質。包含丙位壬內酯在內的內酯類化合物,具有奶香、水果香、堅果香、焦糖香等優良的風味特征,對大曲和白酒整體風味的形成具有重要作用[21]。菌株在60 ℃發酵可以產生酸類物質3-甲基丁酸。王勇等[22]提取牛欄山二鍋頭中的香氣化合物,發現3-甲基丁酸等是聞香強度較高的物質,且具有水果香,對白酒整體香氣貢獻較大。如圖7所示,芳香族、醇類和酯類這3類化合物在30和40 ℃下含量較高。首先,固態發酵相較于液態發酵其發酵時間更長且營養底物更豐富,所以菌株在30和40 ℃的固態發酵條件下也能生長,并代謝了部分發酵產物。此外,風味化合物之間存在相互轉化,部分化合物不僅來源于微生物代謝也可能來源于化學反應。

圖7 菌株LBM32026在不同溫度下的揮發性化合物含量Fig.7 Content of flavor compounds of strain LBM32026 at different temperatures

3 結論與討論

本研究解析了火山渣芽孢桿菌屬與高溫大曲風味化合物的關聯程度。研究結果顯示,Scopulibacillus與大曲中6種風味化合物呈顯著正相關。并以高溫大曲黑曲樣本為篩菌對象,最終得到一株純種菌株ScopulibacillusdaquiLBM32026。研究其在不同溫度下的生長特性,發現菌株在50和60 ℃下生長較為迅速,在30和40 ℃下生長速度變慢甚至出現抑制生長的現象。利用單菌固態發酵實驗分析不同溫度下菌株的風味代謝情況,共檢測到揮發性化合物40種。且在原位體系中與Scopulibacillus顯著正相關的6種風味化合物均被檢測到。隨著發酵溫度的升高,菌株固態發酵產物中的揮發性化合物整體含量、含氮化合物、酚類、醛類、內酯類和酸類化合物含量呈上升趨勢。綜上,菌株LBM32026能夠耐受較高的發酵溫度且發酵風味良好。