應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米粉中嗪胺靈

許秀琴，江瀟瀟，葉宇飛，王麗麗，陳國

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315000)

嗪胺靈又稱嗪氨靈，化學(xué)式為1，4-二(2，2，2-三氯-1-甲酰胺基乙基)哌嗪。分子式為C10H14Cl6N4O2，分子量為434.948，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下[1-3](圖1)：

圖1 嗪胺靈化學(xué)結(jié)構(gòu)式

嗪胺靈是一種酰胺類內(nèi)吸殺菌劑，對谷類、果類、蔬菜的銹病、白粉病以及黑星病等，具有良好的防治效果，亦用于禾谷類拌種處理[4-8]。嗪胺靈的作用是抑制甾醇的生物合成，干擾膜的生成。嗪胺靈雖然對植物安全，但是會破壞動物體內(nèi)的血紅細(xì)胞，對人體造成一定的傷害[9-10]。許多國家對它的最高殘留限量都做了嚴(yán)格的規(guī)定。例如歐盟對505種食品中嗪胺靈的最大殘留量做了相關(guān)規(guī)定，日本對193種食品中嗪胺靈的最大殘留量做了相關(guān)規(guī)定，且歐盟的限量最為嚴(yán)苛，范圍為0.01～0.05 mg·kg-1。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 (GB 2763—2021)對谷物、蔬菜、水果中的嗪胺靈最大殘留限量做了相關(guān)規(guī)定，范圍為0.1～5.0 mg·kg-1。

目前，關(guān)于食品中嗪胺靈的測定研究并不多。陳武瑛等[11]應(yīng)用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中的嗪胺靈，張寧等[12]應(yīng)用氣相色譜法測定了西瓜中的嗪胺靈，而對于谷物中嗪胺靈的測定尚未見報(bào)道。本文應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了大米粉中嗪胺靈的含量，處理方便，條件優(yōu)化簡單。在大米粉中添加了嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，獲得了較好的加標(biāo)回收率。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC 超高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；SIGMA3K15離心機(jī)(北京博勵行有限公司)；Mili Q 超純水儀(美國Millipore 公司)。

嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg·L-1，阿爾塔科技有限公司)；石墨化炭黑/氨基復(fù)合固相萃取柱，500 mg/500 mg/6 mL；甲酸和乙腈(色譜純，美國莫克公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Mili Q 超純水儀所制超純水；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確量取嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg·L-1)0.05 mL用乙腈定容至5.00 mL，得到濃度為10.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

準(zhǔn)確量取嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.00 mg·L-1)1.00 mL用乙腈定容至10.00 mL，得到濃度為1.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃保存，保質(zhì)期為3個(gè)月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用流動相(乙腈∶0.2%甲酸水體積比25∶75)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mg·L-1的嗪胺靈分別為30、40、50、60、70、80、90、100 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫箱溫度：40 ℃；進(jìn)樣量10 μL，流動相：0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)(梯度洗脫)，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子源(ESI+)；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L·h-1；定量離子對434.71>101.57(碰撞能量：32.0 V，錐孔電壓：14.0 V)，定性離子對434.71>75.24(碰撞能量：62.0 V，錐孔電壓：18.0 V)。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

稱取4.00 g大米粉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水，混勻，靜置30 min后加入5 g氯化鈉，20 mL乙腈，均質(zhì)提取1 min，9 500 r·min-1離心10 min，將上清液經(jīng)過裝有10 g無水硫酸鈉的漏斗過濾至120 mL雞心瓶中。再用20 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并提取液于同一雞心瓶中，于45 ℃水浴濃縮至近干，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

石墨化炭黑/氨基復(fù)合固相萃取柱先用10 mL乙腈-甲苯(7∶3，V/V)溶液預(yù)淋洗，棄去全部流出液，將樣品提取液通過固相萃取柱，再用3 mL乙腈-甲苯(7∶3，V/V)溶液分3次洗脫，收集全部流出液，于45 ℃氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確加入1 mL乙腈-0.2%甲酸水(25∶75，V/V)溶解殘?jiān)?jīng)0.22 μm濾膜過濾，供UPLC/-MS/MS測定。

1.5 定性與定量

選擇定量離子對434.71>101.57，嗪胺靈于2.16 min處出峰，采用外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。

圖2 嗪胺靈的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理過程的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)嗪胺靈化學(xué)性質(zhì)選用甲醇、乙腈、乙醇、甲苯溶液作為提取溶劑，結(jié)果表明，甲苯、乙醇對嗪胺靈的提取效率基本無明顯差異，回收率較低，乙腈溶液的回收率較高，最終采用乙腈溶液作為提取液。

2.1.2 SPE柱的選擇

取1.0 mg·L-1嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用流動相乙腈-0.2%甲酸水(25∶75，V/V)溶液稀釋后考察嗪胺靈在Oasis MCX柱、SCX柱、HLB柱、石墨化炭黑氨基復(fù)合柱上的保留情況。固相萃取柱先用10 mL乙腈-甲苯(7∶3，V/V)溶液預(yù)淋洗，棄去全部流出液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液通過固相萃取柱，再用3 mL乙腈-甲苯(7∶3，V/V)溶液分3次洗脫，收集全部流出液，于45 ℃氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確加入1 mL乙腈-0.2%甲酸水(25∶75，V/V)溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。多次結(jié)果表明，嗪胺靈在石墨化炭黑氨基復(fù)合柱上保留效果最好，加標(biāo)回收率均在85%以上，在SCX柱和Oasis MCX柱上的保留效果較差，回收率不足60%。故選擇石墨化炭黑氨基復(fù)合柱。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

采用30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00、90.00、100.0 μg·L-1的嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測試。經(jīng)過儀器條件優(yōu)化，選擇電噴霧正離子源(ESI+)，定量離子對434.71>101.57(碰撞能量：32.0 V，錐孔電壓：14.0 V)，定性離子對434.71>75.24(碰撞能量：62.0 V，錐孔電壓：18.0 V)，離子源溫度：150 ℃，去溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：1 000 L·h-1。嗪胺靈的濃度在30.00～100.0 μg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 方法的檢出限和線性范圍

在空白大米粉樣品中添加5.0 μg·kg-1的嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，由譜圖計(jì)算信噪比(S/N>3)，因此，確定該方法的檢出限為5.0 μg·kg-1。

應(yīng)用30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00、90.00、100.0 μg·L-1的嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以嗪胺靈的峰面積為縱坐標(biāo)y，以嗪胺靈的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。其相應(yīng)的回歸方程為y=37.231x+143.74，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。表明嗪胺靈在濃度為30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00、90.00、100.0 μg·L-1范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

圖3 嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，添加3個(gè)水平的嗪胺靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(分別為0.01、0.04、0.08 mg·kg-1)，進(jìn)行提取、凈化，每個(gè)添加水平平行測定2次，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，進(jìn)行定量分析。圖4為大米粉中添加回收的色譜圖，平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

表2 嗪胺靈的回收率和精密度

圖4 嗪胺靈的添加回收樣品

由表2可得，日內(nèi)平均回收率范圍在86.4%～94.8%，日間的回收率范圍在82.4%～98.5%，精密度CVR為3.9%。

3 結(jié)論

本文建立了一種采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 UPLC-MS/MS法測定大米粉中嗪胺靈的方法，樣品處理方便，所用試劑少，處理時(shí)間短，采用石墨化炭黑氨基復(fù)合柱，回收率高，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到藥物殘留分析的要求。