基于高通量測序技術(shù)的林下三七土壤微生物多樣性研究

熊冰杰何舒張澳黃佑國王美玲嚴星茹何霞紅施蕊

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/昆明生態(tài)林業(yè)產(chǎn)業(yè)國際科技研發(fā)中心，云南昆明 650224)

三七[Panax notoginseng(Burk.) F. H.Chen]為五加科人參屬植物，具有活血化瘀、預(yù)防冠心病以及滋補強壯等功效[1-2]，在醫(yī)藥行業(yè)、化妝品行業(yè)、保健品行業(yè)備受歡迎，需求量逐年增加[3]。 三七通常以根部入藥，近些年三七莖、花[4-6]也被廣泛應(yīng)用。 由于三七連作障礙嚴重[7-8]，近年來適宜種植三七的土地面積持續(xù)下降。 微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成分，與中藥材之間存在共生關(guān)系。 土壤的營養(yǎng)狀況會直接改變微生物的種群結(jié)構(gòu)，調(diào)控中藥材的藥用活性[9]。 三七從土壤中吸收所需養(yǎng)分，土壤中微生物含量的多寡對三七的健康成長至關(guān)重要[10]。通過外源添加營養(yǎng)元素改善土壤的理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)等，為植物創(chuàng)造良好的生長環(huán)境，可促進植物生長[9，11-13]。 土壤性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)的改變影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，特定的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對于穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)和維持土壤生態(tài)功能至關(guān)重要[14-17]。

以堿性植煙土壤為試驗材料進行深耕+有機肥處理后，土壤有機質(zhì)、養(yǎng)分及酶活性升高[18]，“清香”核桃施專用肥后土壤氮、磷等含量明顯增加[19]。 施肥量對土壤性質(zhì)的影響各不相同，在適宜的范圍內(nèi)枇杷土壤的優(yōu)勢菌門豐度隨施肥量的增加而增加，其中施肥枇杷土壤中的變形菌門豐度顯著增加[20]。 蓖麻餅和蚯蚓糞的使用提高了土壤的酸性和磷酸鹽、N、P、S 含量，加劇土壤的生物循環(huán)過程，從而提升植物的生長和產(chǎn)量[21]。蚯蚓糞不僅增加了番茄根際土壤微生物的數(shù)量，而且能夠均衡生物菌群的種類[22]。 李曉英[23]研究發(fā)現(xiàn)，施用適量的生物質(zhì)炭基液態(tài)肥能夠改善杜鵑土壤的理化性質(zhì)，促進杜鵑花的生長及提高其成花率和花期效果，使杜鵑花在形態(tài)和感官等方面的價值得到提升。 本課題組前期研究表明，施用適量有機肥后，林下三七品質(zhì)明顯提升，且主要活性成分含量增加，尤其是衡量三七質(zhì)量標準的主要物質(zhì)——萜類化合物。 為進一步探究生物菌有機肥對三七品質(zhì)的影響，本研究以林下施有機肥的三七土壤為研究對象，分析三七土壤微生物的變化，以期為種植高品質(zhì)三七提供栽培技術(shù)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗在云南省昆明市尋甸縣林下三七種植基地(N25°28'，E103°12'；海拔2 199 m)進行。

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 生物菌有機肥及施用量生物菌有機肥:以有機碳、生物菌、多肽類物質(zhì)等為營養(yǎng)元素。

施肥方法及用量:在松樹林下起壟時，將基肥均勻施于壟頂表面，與土壤拌勻，移栽三七種苗，在三七開花后追肥。 基肥量30 000 kg/hm2，追肥量4 200 kg/hm2。 以不施生物菌有機肥為對照。

1.1.2 樣品采集采用五點取樣法取2年生花蕾前的施肥(T)、不施肥(CK)處理三七樣本(每處理樣本3個重復(fù))，同時收集每株三七根際土壤，20 目篩去除雜物，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定項目及方法

1.2.1 土壤檢測按照DNA 提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]基于CTAB 法提取DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量DNA 于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL，以稀釋后的DNA 為模板，使用含有Barcode 的特異引物515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3')擴增樣品的16S rDNA V4 區(qū)序列。PCR 反應(yīng)體系:2×Phusion Master Mix 15 μL，正反向引物(2 μmol/L)各1.5 μL，gDNA 模板10 μL，加去離子水至30 μL。 擴增程序:98 ℃預(yù)變性1 min； 98 ℃變性10 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。 使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對目的條帶使用膠回收試劑盒(Qiagen 公司) 回收產(chǎn)物。 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量，使用NovaSeq 6000 進行上機測序。

1.2.2 三七基本參數(shù)測量將取回的各處理三七植株用自來水沖洗干凈根系后濾紙吸干表面水分。 使用直尺測量主根長度，記作根長；測量主根和莖接觸部位至小葉柄下端的長度，記作株高；用電子天平稱量根部鮮重，隨后放入烘干機中烘干，稱量干重。

1.2.3 三七次生代謝產(chǎn)物檢測取0.1 g 三七(試驗組T)粉末溶于1.2 mL 70%甲醇提取液中；溶解后放入4 ℃冰箱過夜，期間渦旋6 次；離心(轉(zhuǎn)速12 000 r/min，10 min)后吸取上清，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析；不施肥組(CK)與試驗組做相同處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Qiime 軟件計算多樣性指數(shù)，R 軟件繪制PCA 圖、韋恩圖、聚類圖、KEGG 富集圖，Cytoscape 軟件繪制網(wǎng)狀圖，采用SPSS 19.0 進行土壤數(shù)據(jù)分析。 在UPLC-MS/MS 檢測平臺和自建數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，利用軟件Analyst1.6.3 與多元統(tǒng)計相結(jié)合分析三七成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七生長參數(shù)比較

由表1 可知，T 處理在株高、根長、根鮮重和根干重方面均高于CK，可見，施用生物菌有機肥可促進三七植株的生長。

2.2 土壤微生物多樣性檢測

2.2.1 有機肥對土壤細菌多樣性的影響兩處理的Shannon 指數(shù)在8.461～8.926 之間，Simpson指數(shù)在0.985 ～0.993 之間，說明兩組樣本中土壤細菌群落多樣性較高，但差異不顯著。 前人研究結(jié)果顯示[20-22]，有機肥的施用能夠改善土壤質(zhì)量，促進植物生長，但在林下環(huán)境中施肥對土壤細菌多樣性的影響并不明顯。

使用PCA 對土壤細菌的變化做進一步分析(圖1)，T 組和CK 組在第一主成分呈現(xiàn)分離；兩組樣本共有OTU 數(shù)2 663個，特有OTU 數(shù)分別為633 和749(圖2)。 由PCA 和韋恩圖可知，兩組樣本之間不僅存在相同之處也呈現(xiàn)各自特有的性狀。

圖1 土壤細菌群落PCA 分析圖

圖2 基于OTU 的韋恩圖

2.2.2 有機肥對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響在兩組三七根際土壤中共檢測到41 門、50 綱、119目、206 科、389 屬和213 種。 在門水平上(表2)，林下三七土壤細菌主要包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)，這與前人研究[24-26]結(jié)果一致。 與CK 相比，T 處理中變形菌門(Proteobacteria，55.576%)、放線菌門(Actinobacteria，19.509%)豐度顯著增加， 而酸桿菌門( Acidobacteria，12.267%)豐度降低。 變形菌門和放線菌門豐度的增加能夠降解土壤中不易被分解的物質(zhì)，增強土壤環(huán)境的抵抗能力，促進土壤微環(huán)境的循環(huán)[27]；同時能夠促進植物根際分泌物的產(chǎn)生，加快林下腐殖土的分解。 在屬水平上(表3)，與CK相比，T 處理組變形菌門(Proteobacteria)中的羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)和放線菌門(Actinobacteria)中的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)豐度明顯增加，羅河桿菌屬種群被證明對根腐真菌病原體腐皮鐮孢霉菌(Fusarium solani)具有拮抗作用，并且可能參與氮循環(huán)過程。 酸桿菌門(Acidobacteria)中的Bryobacter豐度下降，馬賽霉菌屬(Massilia)的菌群豐度明顯降低。

表2 基于門水平各樣本前10 的土壤細菌優(yōu)勢群落占比

表3 基于屬水平各樣本前10 的土壤細菌優(yōu)勢群落占比

2.3 三七次生代謝產(chǎn)物檢測

兩組三七樣本中共檢測到664 種次生代謝產(chǎn)物，差異代謝物175 種，包括萜類、黃酮類、生物堿類、酚酸類、脂類、氨基酸及其衍生物等10 類次級代謝產(chǎn)物。 其中萜類差異代謝物11 種，黃酮類差異代謝物15 種，生物堿類差異代謝物11 種，酚酸類差異代謝物33 種(包括上調(diào)4 種，下調(diào)29 種)，脂類差異代謝物19 種，氨基酸及其衍生物20 種。在PCA 分析中(圖3)，兩組樣本第一主成分明顯分離，與三七根際土壤樣本的檢測結(jié)果相似。 聚類分析顯示(圖4)，兩組樣本中的高表達量物質(zhì)種類不同。 由此可知，兩組試驗樣本存在差異。

圖3 三七次生代謝產(chǎn)物PCA 分析圖

圖4 樣品聚類分析圖

兩組樣本中被KEGG 注釋到的代謝物有263個，其中差異顯著的代謝物有84個。 KEGG 富集分析顯示(圖5)，代謝途徑(metabolic pathways)和次生代謝產(chǎn)物合成途徑(biosynthesis of secondary metabolites)富集到差異代謝物數(shù)量最多，分別為71個和37個。 咖啡因代謝途徑(caffeine metabolism)及膦酸酯和次膦酸酯代謝(phosphonate and phosphinate metabolism)的富集因子為1，說明這兩條通路富集顯著。

圖5 差異代謝物KEGG 富集圖

酚類和萜類是高等植物的主要化感物質(zhì)，酚類物質(zhì)是造成土壤連作障礙的主要因素之一。 在檢測到的175 種差異代謝物中，酚酸類物質(zhì)占比最高。 表4 顯示，2-(甲酰氨基)苯甲酸、對香豆酸、順丁烯二酰基-咖啡酰奎寧酸、3-O-阿魏酰奎寧酸、異綠原酸C 在T 處理中未檢測到，而3-氨基水楊酸在CK 處理中未檢測到。 酚酸濃度在中高水平會引起膜結(jié)構(gòu)損傷，相對較低濃度的苯甲酸對三七根的生長有促進作用，超過適量的濃度后就會抑制其生長[28-29]。

表4 三七中19 種酚酸類差異代謝物

2.4 土壤微生物與三七品質(zhì)的關(guān)系

土壤中微生物菌群的變化直接影響三七的健康和效用。 利用土壤細菌與三七代謝物構(gòu)建網(wǎng)狀圖(圖6)，進一步分析土壤細菌與三七生長之間的關(guān)系。 在門水平上，6 種土壤細菌和41 種三七代謝產(chǎn)物相關(guān)。 例如，酸桿菌門與肌醇、單酰甘油酯(18∶1)、溶血磷脂酰膽堿18∶1 呈正相關(guān)，與對羥基扁桃腈、L-蛋氨酸、L-瓜氨酸呈負相關(guān)；疣微菌門與煙酸核糖核苷、2'-脫氧肌苷-5'-單磷酸呈正相關(guān)，與甲基馬來酸、L-精氨酸、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、黃苷、鳥苷3'，5'-環(huán)單磷酸、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0 呈負相關(guān)；Parcubacteria 與L-色氨酸、綠原酸甲酯正相關(guān)。 在屬水平上，84 種土壤細菌和41 種三七次生代謝物相關(guān)。 例如，羅河桿菌屬與延胡索酸(富馬酸，反丁烯二酸)正相關(guān)，與D-木糖酸、3-羥丙基棕櫚酸酯葡萄糖胺負相關(guān)；鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)與9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0 正相關(guān)，與D-果糖負相關(guān)；馬賽霉菌屬(Massilia)與咖啡酸、5-O-對香豆酰奎寧酸、3-O-對香豆酰奎寧酸、綠原酸、Ixerisoside D 正相關(guān)；藤黃單胞菌(Lu-teimonas)與咖啡酸、5-O-對香豆酰奎寧酸、3-O-對香豆酰奎寧酸、綠原酸、Ixerisoside D 負相關(guān)。以上說明，在不同菌群水平上，土壤微生物與酚酸類、萜類、黃酮類、有機酸、生物堿、氨基酸、脂類等代謝產(chǎn)物息息相關(guān)。

圖6 土壤細菌與三七代謝物的相關(guān)性網(wǎng)狀圖

3 討論與結(jié)論

施用化肥會使土壤板結(jié)、微生物多樣性降低，外源施用有益菌是快速改變土壤質(zhì)量的有效途徑。 農(nóng)家肥與秸稈配施可以提高土壤中變形菌門和放線菌門的相對豐度[30]，同時降低酸桿菌門的豐度，本研究與上述結(jié)果一致。 變形菌門、酸桿菌門、放線菌門是林下三七土壤中三大主要菌門。變形菌門具有固定氮源和清除污染物功能，有利于土壤物質(zhì)的代謝[26]；放線菌門有利于土壤中有機殘骸的分解[31]，增強環(huán)境抗脅迫能力[32]，促進植物吸收土壤中的養(yǎng)分。 這兩種菌門豐度的增加，有助于緩解土壤的連作障礙。 本研究中處理組酸桿菌門豐度低于對照組，酸桿菌門的豐度越低土壤的品質(zhì)越好[33]，該結(jié)論在穿心蓮試驗中也得到了證實[34]。 土壤中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等核心菌群豐度的變動有助于平衡土壤內(nèi)部激素，促進植株生長，提升植物的抗病性和養(yǎng)分利用率[35-37]。

植物的生長與土壤、土壤微生物密不可分，土壤-微生物-植物三者形成一個微環(huán)境。 三七與土壤中的變形菌門、酸桿菌門、放線菌門之間存在著密不可分的關(guān)系。 施用適量有機肥后，土壤微生物群落發(fā)生了改變，同時改變了植物中酚酸類、類黃酮、脂類和生物堿類化合物的組成。 植物中代謝物變化最顯著的是酚酸類物質(zhì)，而酚酸類物質(zhì)是重要的化感自毒物質(zhì)，是引起植物連作障礙的關(guān)鍵因素之一[28]。 本試驗中，處理組中酚酸類代謝物上調(diào)4 種，下調(diào)29 種。 2-(甲酰氨基)苯甲酸、對香豆酸、順丁烯二酰基-咖啡酰奎寧酸、3-O-阿魏酰奎寧酸、異綠原酸C 在處理組中未檢測到。 黃小芳等[38]研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸會改變植物根細胞的正常運轉(zhuǎn)，導(dǎo)致植株體內(nèi)的細胞活動錯亂，抑制人參幼苗根部的生長；對香豆酸類酚酸物質(zhì)可降低西洋參幼苗期的株高[39]，也可能存在抑制其他植物生長的作用[40-41]。 皂苷是三七中主要的有效成分，T 組中的皂苷含量多于CK 組，這說明施肥對三七的生長有益。 以上研究表明，有機肥對三七的有效生物量、次生代謝產(chǎn)物以及土壤微生物的種類、菌群豐度等都有影響。 對土壤細菌與代謝物的相關(guān)性網(wǎng)狀分析顯示，馬賽霉菌屬與5-O-對香豆酰奎寧酸、3-O-對香豆酰奎寧酸、咖啡酸呈正相關(guān)。 植物病原體能夠增加咖啡酸的釋放，降低土壤微生物的多樣性[42]。 咖啡酸的富集表明三七植株可能受到了土傳病原體的影響。 有行業(yè)學(xué)者指出[24]，三七的產(chǎn)量與皂苷量不僅與植物遺傳因子有關(guān)，與三七的土壤環(huán)境也密不可分。

綜上所述，施用適量有機肥有助于提升林下三七的土壤質(zhì)量，緩解三七的連作障礙，本試驗為進一步種植高品質(zhì)林下三七奠定了基礎(chǔ)。