不同培養條件對長枝木霉SMF2 和哈茨木霉T39生長與產孢的影響

趙曉彤王桂清

(聊城大學農學與農業工程學院，山東聊城 252000)

生防真菌在防治作物病害(尤其是土傳病害)方面發揮著巨大作用，其中研究最多和應用最廣的為木霉菌(Trichodermaspp.)[1]。 木霉菌廣泛分布于不同生態環境中，以豐富的次生代謝物和強大的競爭能力及重寄生特性實現其生物防治作用，在土壤修復、促進植物生長和控制病害方面發揮著重要作用[2]，可作為高效、經濟、環保的原材料應用于工業和農業生產[3]。 因其具有生長分布的廣泛性、種類株系的適應性、拮抗真菌的廣譜性、活性物質的多樣性、作用機制的復雜性和對環境的友好性等特點而成為最有應用前途的生防因子[4-6]。

最為常見的木霉菌有哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和綠色木霉(Trichoderma viride)等。 哈茨木霉是目前農業生物防治中最具商業化價值的木霉菌，應用廣泛；長枝木霉是較為常見的拮抗類木霉，在植病生防中越來越受到重視。 哈茨木霉T22、T39 作為生防產品已登記注冊，不僅可以誘導寄主防御基因表達產生抗病性而防治植物病害，還可以促進作物生長進而提高生物量[7-9]。 長枝木霉SMF2 主要通過產生抗菌肽康寧霉素(trichokonins， TKs)而對植物病害產生抑制作用，同時對苦瓜、白三葉草等植物具有明顯的促生作用[1，10]。

木霉菌種類不同、菌株不同，其生態適應性也不同。 綠色木霉TR-8、哈茨木霉TH-1 均可在PDA 培養基上正常生長；光照可促進孢子產生，但二者最適生長溫度、pH 值等略有不同；微量元素Mn 對TR - 8 菌絲生長有一定的促進作用[11-12]。 生物學特性是研究真菌繁殖條件、發生規律、生態調控等方面的理論基礎，對生防菌的科學利用具有指導作用[13]。 本試驗通過研究不同培養條件下長枝木霉SMF2 和哈茨木霉T39 的生物學特性，明確其生長繁殖條件，為其人工擴繁和工廠化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種為長枝木霉(T. longibrachiatum)SMF2 和哈茨木霉(T. harzianum)T39，由聊城大學植物病理實驗室提供。

將供試菌種在(25±1) ℃、L ∶D(光照∶黑暗)＝12 h ∶12 h 的恒溫光照培養箱內采用PDA 培養基培養3 d 后，用打孔器取直徑0.7 cm 的菌餅備用。

1.2 試驗設計

1.2.1 培養基供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA:去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、察氏培養基(CDA:葡萄糖20 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.6 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、天門冬酰胺5 g、CaCl20.1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、燕麥培養基(OMA:燕麥片40 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、基礎固體培養基(BCM:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、K2HPO41 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、麥芽糖瓊脂培養基(MEA:麥芽糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)[15]共5 種。

1.2.2 溫度以PDA 培養基為營養源，溫度范圍5～40 ℃之間，設置5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8個處理。

1.2.3 光照以PDA 培養基為營養源，設置全光照、光暗交替(L ∶D＝12 h ∶12 h)、全黑暗3個處理。

1.2.4 pH 值以PDA 培養基為營養源，使用1.0 mol/L HCl 溶液和1.0 mol/L NaOH 溶液調節PDA培養基的pH 值，設pH 值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 共10個處理。

1.2.5 碳源以CDA 培養基作為基礎培養基，用供試碳源等量替換其中的葡萄糖(標準碳)，制成不同碳源培養基。 供試碳源選用蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、微晶纖維素共8 種，并以無碳處理作為空白對照。

1.2.6 氮源以CDA 培養基作為基礎培養基，用供試氮源等量替換其中的天門冬酰胺(標準氮)，制成不同氮源培養基。 供試氮源選用硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、甘氨酸共7 種，并以無氮處理作為空白對照。

1.3 測定項目及方法

將高壓濕熱滅菌后的培養基制成平板(直徑9 cm)，于培養皿內接種木霉菌餅，1 皿1 餅，重復3 次。 研究不同培養基、溫度、光照、pH 值、碳源和氮源對SMF2、T39 菌絲生長和產孢量的影響。不同處理分別于(25±1) ℃、L ∶D ＝12 h ∶12 h 的恒溫光照培養箱培養48 h 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，72 h 后用相機拍照記錄培養性狀，采用血球計數法計算產孢量[14-15]。

1.4 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2020 處理數據，用Adobe Photoshop 2020 軟件處理照片，用DPS 19.05 中的Duncan’s 法進行多組樣本間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

圖1 顯示，SMF2、T39 在5 種供試培養基中均可生長，菌絲生長呈輻射狀，色素顏色為黃綠色，培養基不同菌絲色素顏色深淺不同。 其中，二者在MEA 培養基上生長均不理想，菌絲稀薄，不產生色素，產孢量小。

圖1 不同培養基條件下兩種木霉培養結果比較

不同培養基條件下兩種木霉菌絲生長速度和產孢量存在差異。 由圖2 可知，二者在PDA 培養基上生長狀況最好，菌落大、菌絲生長旺盛，產孢量大。 SMF2 菌落直徑達7.69 cm，是T39 的1.25倍(表1)，產孢量為2.64×1010個/皿；T39 菌落直徑為6.16 cm，產孢量為3.86×1010個/皿。 在CDA、OMA、BCM 培養基上，二者生長狀況較好，T39 的產孢量是SMF2 的1.27～6.55 倍(表1)，且T39 在CDA 上的產孢量高達4.58×1010個/皿。

表1 不同培養基下SMF2 與T39生物量的倍數比較

圖2 不同培養基對兩種木霉菌絲生長和產孢量的影響

綜合菌絲生長速度、產孢量和培養性狀，PDA為SMF2 菌株生長發育的最佳培養基，CDA 為T39 的最佳培養基。 T39 菌株的產孢能力明顯大于SMF2。

2.2 不同溫度對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

由圖3 可知，兩種木霉在25 ～35 ℃范圍內菌絲生長旺盛，呈輻射狀，菌落致密，在整個培養基上密布成堆。 當培養溫度≤20 ℃或高達40 ℃時，兩種木霉生長狀況均較差，菌絲稀薄，產孢量少。

圖3 不同溫度條件下兩種木霉培養結果比較

由圖4 可知，供試溫度范圍內，隨著溫度升高，兩種木霉的菌落直徑和產孢量均呈現先升高后降低的變化。 SMF2 的菌落直徑和產孢量拐點均出現在35 ℃，菌落直徑最大達8.75 cm，是T39的1.29 倍(表2)，產孢量最高達61.06×108個/皿；而T39 的菌落直徑拐點出現在25 ℃，最大達8.35 cm，產孢量拐點出現在30 ℃，最高達206.46×108個/皿。 5～30 ℃范圍內，同一溫度下，T39 的產孢能力強于SMF2，前者的產孢量是后者的1.11～23.83 倍(表2)；而35～40 ℃時，T39 的產孢能力低于SMF2，后者的產孢量是前者的1.06 ～1.96倍。

表2 不同溫度條件下SMF2 與T39生物量的倍數比較

表明兩種木霉在最適培養溫度上有差異，SMF2 的菌絲生長和產孢最適溫度均為35 ℃，T39 的菌絲生長最適溫度為25 ～30 ℃，產孢最適溫度為30 ℃。 相同溫度下T39 產孢量整體較高。

2.3 不同光照對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

圖5 顯示，SMF2、T39 在3 種不同光照條件下均能正常生長，菌落致密，菌絲呈輻射狀，生長旺盛。 二者在全光照條件下產孢最多，光暗交替條件下次之，全黑暗條件下最少。

圖5 不同光照條件下兩種木霉培養結果比較

由圖6 可知，不同光照條件下，SMF2、T39 的菌落直徑范圍分別為6.31 ～8.13、5.75 ～6.67 cm，且菌落直徑均在全黑暗條件下達到最大，全光照條件下次之，光暗交替條件下最小。 SMF2 菌絲生長較快，是T39 的1.05～1.22 倍(表3)。

表3 不同光照條件下SMF2 與T39生物量的倍數比較

圖6 不同光照條件下兩種木霉菌絲生長和產孢量比較

T39、SMF2 產孢量均在全光照條件下達到最大，分別為33.83×108、9.50×108個/皿；不同光照條件下，T39 的產孢量為SMF2 的2.45 ～4.14 倍(表3)。 表明光照條件能夠有效增加二者的產孢量，且同一光照條件下，T39 產孢量明顯高于SMF2。

2.4 不同pH 值對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

圖7 顯示，兩種木霉在pH 值為4～11 條件下均可生長，菌落相對致密，菌絲生長比較旺盛，孢子均勻密布整個培養基；但極強的酸、堿環境即pH 值為3、12 條件下，二者生長狀況較差，pH 值為12 條件下菌絲生長緩慢，菌落較小，產孢量較少；pH 值為3 條件下由于酸性過大，培養基無法凝固，兩種菌生長緩慢，產孢極少。

圖7 不同pH 值條件下兩種木霉培養結果比較

由圖8 可知，pH 值為4～11 條件下，SMF2、T39 的菌絲生長和產孢量存在明顯差異。 SMF2的菌落直徑范圍為6.51～8.45 cm，pH 值為9 時菌落直徑最大；T39 的菌落直徑范圍為4.95 ～7.48 cm，pH 值為4 時菌落直徑最大，且隨pH 值增大整體呈減小趨勢。 pH 值為4～5 時，T39 的菌絲生長比較快，其菌落直徑是SMF2 的1.07 ～1.15 倍；pH 值為6～11 時，SMF2 的菌絲生長比較快，其菌落直徑是T39 的1.17～1.59 倍(表4)。

表4 不同pH 值條件下SMF2 與T39生物量的倍數比較

圖8 不同pH 值條件下兩種木霉菌絲生長和產孢量比較

pH 值為4 ～11 條件下，SMF2 的產孢量為(0.46～2.91)×1010個/皿，pH 值為7 時孢子量最多；T39 的產孢量為(1.48 ～5.22)×1010個/皿，pH值為6 時孢子量最多。 相同pH 值下T39 的產孢量是SMF2 的1.25～4.20 倍(表4)。

表明中性偏堿環境有利于SMF2 的生長和繁殖，其菌絲生長和產孢的最適pH 值分別為9 和7；偏酸條件則更有利于T39 的生長發育，其菌絲生長和產孢的最適pH 值分別為4 和6。

2.5 不同碳源對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

圖9 顯示，兩種木霉在無碳培養基上可產孢，但產孢量較少、生長較差，菌落直徑相對較小，菌絲稀疏；在其他碳源培養基上菌絲生長均較旺盛，產孢量大，呈輻射狀，分生孢子密布于菌落上。 不同碳源處理下兩種木霉的生長發育狀況較無碳對照均明顯提高，表明其對碳源的要求不嚴格，但對單糖(果糖、阿拉伯糖)的利用效果優于雙糖(海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)和多糖(可溶性淀粉、微晶纖維素)。 微晶纖維素由于自身溶解性較差，以其為碳源時，菌絲生長和產孢能力不理想，但其生長發育狀況仍優于無碳對照。

由圖10 可知，無碳條件下，SMF2 和T39 菌落直徑均低于5 cm，產孢量不超過1.00×1010個/皿。不同碳源處理下，SMF2 的菌落直徑為5.16 ～7.71 cm，產孢量為(0.95 ～1.62)×1010個/皿，分別是無碳培養基的1.06～1.59、2.71～4.63 倍；T39 的菌落直徑為4.20 ～5.62 cm，產孢量為(1.56 ～2.50)×1010個/皿，與無碳培養基相比，前者產孢量是后者的1.68～2.69 倍，菌落直徑的倍數關系在1.01～1.36 之間，差異較小。 阿拉伯糖為SMF2 和T39菌絲生長的最適碳源，果糖為二者產孢的最佳碳源。

圖10 不同碳源條件下兩種木霉菌絲生長和產孢量比較

由表5 可知，不同碳源條件下，SMF2 的菌絲生長較快，菌落直徑是T39 的1.23 ～1.47 倍；T39的產孢能力明顯大于SMF2，前者是后者的1.10 ～1.64 倍。

表5 不同碳源條件下SMF2 與T39 生物量的倍數比較

2.6 不同氮源對兩種木霉菌絲生長和產孢能力的影響

圖11 顯示，無氮條件下，兩種木霉的孢子肉眼幾乎不可見。 相比較無氮對照，兩種木霉在以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、甘氨酸為氮源的培養基上生長良好，菌絲致密，產孢量較多；而在其他氮源培養基中，菌絲稀薄，產孢量少，生長、產孢均不理想。

圖11 不同氮源條件下兩種木霉培養結果比較

由圖12 可知，不同氮源條件下兩種木霉的菌絲生長差異明顯。 在以有機氮(蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏)、氨基酸態氮(甘氨酸)為氮源的培養基上生長速率均快于銨態氮(硫酸銨、氯化銨)和硝態氮(硝酸鈉)。 在有機氮、氨基酸態氮為氮源的培養基上菌落直徑為4.28 ～7.69 cm，在其他氮源培養基上的菌落直徑僅為0.92 ～1.87 cm。 其中，SMF2 在有機氮、氮基酸態氮、硝態氮為氮源的培養基上菌落直徑大于T39，前者是后者的1.03～1.39 倍(表6)。

表6 不同氮源條件下SMF2 與T39 生物量的倍數比較

圖12 不同氮源條件下兩種木霉菌絲生長和產孢量比較

無氮條件下，SMF2 和T39 的菌落直徑分別為3.72、4.72 cm，產孢量為9.17×108、73.75×108個/皿。不同有機氮源條件下，SMF2 產孢量達到(304.38～528.33) ×108個/皿，T39 產孢量達到(91.88～159.38)×108個/皿，SMF2 的產孢量是T39的2.94～5.69 倍；而以硝態氮和銨態氮為氮源時，T39 的產孢能力增強，其產孢量是SMF2 的2.73 ～4.68倍(表6)。

添加有機氮源培養基的SMF2 和T39 菌落直徑、產孢量分別是無氮源添加的1.11 ～2.07、1.25 ～57.64倍。 且兩種木霉的菌落直徑和產孢量均在有機氮源培養基中達到最大值，其菌落直徑和產孢量的最佳氮源分別為酵母浸膏和牛肉膏，表明二者對有機氮源的利用情況優于其他氮源。

3 討論

培養基、溫度、光照、酸堿度、碳源和氮源均對木霉菌的菌絲生長和孢子形成有不同影響。

3.1 不同培養基對兩種菌培養的影響

培養基是微生物學研究和微生物發酵工業的基礎，其營養組成直接影響微生物生長發育。 目前培養木霉菌常用的培養基有PDA、CDA、MEA、PSA、糖漿培養基、玉米粉葡萄糖培養基、小麥汁培養基和玉米培養基[16]等。 馬鈴薯是PDA 的重要組分，含有豐富的B 族維生素、纖維素、微量元素、氨基酸、蛋白質、脂肪和優質淀粉等營養元素，為微生物生長提供充裕碳源、氮源、維生素和無機鹽；葡萄糖是活細胞的能量來源和新陳代謝的中間產物，能夠提供優質碳源。 CDA 中葡萄糖和天門冬酰胺為重要的碳源、氮源，含量較高的氯化鈉具有抑制細菌和減緩毛霉生長的作用，其他成分則提供必需離子；OMA 中的燕麥含有豐富的蛋白質、脂肪、淀粉、微量元素和膳食纖維，是氮源、碳源和微量元素等的重要來源；BCM 中的牛肉膏和蛋白胨為碳源、氮源、磷酸鹽和維生素的主要來源，氯化鈉則提供無機鹽。

有研究表明，長枝木霉T05 在PDA、MEA、CDA、BCM 上都能生長，且菌絲在PDA 上生長最快[17]；哈茨木霉TH-1 分別在PDA、MEA、CDA、BCM 上培養均能產孢，其中PDA 為最適培養基[12]。 本試驗中PDA、CDA、OMA、BCM 四種培養基因營養成分豐富，成為SMF2 和T39 菌絲生長及孢子繁殖的適宜培養基，以PDA 和CDA 最佳，而MEA 培養基成分單一，除凝固劑瓊脂外，僅含有麥芽糖，故兩種木霉在其上生長發育不理想。這與前人研究結果大體一致，進一步證明木霉菌株對營養環境的廣泛適應性。

3.2 不同溫度對兩種菌培養的影響

木霉菌是一種嗜溫真菌，棘孢木霉PZ6 在15～37 ℃均能生長，25～37 ℃菌絲生長較好，以30 ℃菌絲生長最快[16]；長枝木霉HQ1、非洲哈茨木霉BB12 菌株適宜培養溫度為28 ～33 ℃[18]。 本試驗中T39、SMF2 在25 ～35 ℃范圍內生長發育良好；在高溫(40 ℃)或低溫(20 ℃及以下)環境條件下，由于沒有達到木霉菌生長發育的起點溫度或有效積溫積累不足，或者環境溫度過高導致菌體內蛋白質、核酸等重要組成物質遭受不可逆的破壞，致使其生長較差。

3.3 不同光照對兩種菌培養的影響

光為木霉菌菌絲生長和孢子形成提供能量。光照對哈茨木霉TH-1 菌絲生長影響不大但明顯影響菌株產孢量，光照時間越長產孢量越大[12]；全黑暗條件有利于長枝木霉GAAS L3-1-0.8 菌絲的營養生長，而光暗交替條件則對產孢有利[19]，即光照可以促進分生孢子產生。 本試驗中T39、SMF2 在全光照、光暗交替、全黑暗3 種條件下均可正常生長，全黑暗條件對菌絲生長更為有利，而全光照條件對產孢更有利。 這與前人的研究結果相吻合，且相同光照條件下，長枝木霉SMF2 菌絲生長較快，而哈茨木霉T39 產孢量更大。

3.4 不同pH 值對兩種菌培養的影響

pH 值不僅通過影響真菌體內的酶活性而影響酶促反應效率，而且還通過影響膜結構穩定性和細胞質膜的通透性而影響其對營養物質的吸收。 有研究表明，棘孢木霉PZ6 最適生長和產孢的pH 值為5 ～9[16]；哈茨木霉Th-81、短密木霉(T. brevicompactum)Tb-50 和長枝木霉T1-70 在pH 值為2 ～7 時均能生長，最適生長的pH 值為4[20]。 本試驗中，T39、SMF2 對酸堿度的適應性較強、范圍較廣，在pH 值為4 ～11 條件下均生長較好，且中性至弱堿性(pH 值7～9)為SMF2 培養的最佳酸堿條件，其菌絲生長、產孢最適pH 值分別為9 和7；T39 培養的最佳酸堿條件為弱酸和偏酸(pH 值4～6)，其菌絲生長、產孢最適pH 值分別為4 和6。

3.5 不同碳源對兩種菌培養的影響

碳源物質是真菌生長的碳素來源。 木霉菌對單糖、雙糖、多糖、嘌呤、嘧啶和氨基酸等的利用效果均較好[21]。 不同木霉菌其最適碳源有所差異，長枝木霉GAAS L3-1-0.8 以葡萄糖、麥芽糖、果糖和乳糖為碳源時，菌絲生長和產孢較好，葡萄糖為最適碳源[19]；木糖、果糖和蔗糖有利于哈茨木霉T21 的菌絲生長和產孢，木糖為最適碳源[22]。本試驗中，SMF2 和T39 在無碳源添加的培養基中雖能生長，但其菌絲質量和產孢量均不理想。碳源的加入提供了必要的營養物質，提升其生長發育質量。 微晶纖維素主要成分為以β-1，4-葡萄糖苷鍵結合的直鏈式多糖類物質，由于自身不易溶解致使碳源的促生作用較差。 單糖(果糖、阿拉伯糖)補充熱能的效果比雙糖、多糖更快，故以果糖和阿拉伯糖為碳源時SMF2 和T39 的生長發育最優，且SMF2 的菌絲生長優于T39，但T39的產孢能力更強，這可為二者混合使用以防治病害提供理論基礎。

3.6 不同氮源對兩種菌培養的影響

氮源是真菌生長的重要氮素來源，主要用于合成蛋白質等含氮物質，有助于產孢。 有機氮源像蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏等成分復雜、營養豐富，微生物在其培養基中常表現出生長旺盛、菌體增長迅速等特點。 有研究表明，蛋白胨和酵母膏分別為長枝木霉T05 和GAAS L3-1-0.8 營養生長和產孢的最適氮源[17，19]，哈茨木霉T21 在以牛肉膏為氮源的培養基中菌絲生長和產孢最優[22]。氨基酸態氮(甘氨酸)存在于土壤蛋白質和多肽類化合物中，降解后只釋放出相應的氨基酸為微生物生長發育提供單一營養；硝態氮和銨態氮為無機氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉)，易被菌體直接利用，促進菌體生長，但與有機氮源相比，因其成分簡單、缺乏營養物質、利用效率低致使木霉菌菌絲稀薄、產孢量較少。 因此，相比于氨基酸態氮、硝態氮和銨態氮，SMF2 和T39 在以有機氮(蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏)為氮源的培養基中生長發育更優，有機氮源為SMF2 和T39 生長發育的適宜氮源，這與前人的研究結果一致。 且SMF2 和T39 對氮源的要求相較于碳源而言更嚴格。

4 結論

本研究結果表明，SMF2 和T39 具有廣泛的適應性，對環境條件要求不嚴格，在常溫、黑暗、非強酸強堿、含有碳源和有機氮源的條件下，二者的菌絲生長和孢子形成狀況均較為優良。 光照、果糖、牛肉膏更有利于二者孢子形成；PDA 和CDA最適宜產孢；且二者對氮源的要求相較于碳源而言更嚴格，兩種木霉在無碳條件下可產孢，但產孢量較少，而在無氮條件下孢子肉眼幾乎不可見。SMF2 和T39 在添加碳源培養基中的菌落直徑、產孢量是無碳源添加的1.01 ～1.59、1.68 ～4.63倍，而在添加有機氮源培養基中的菌落直徑、產孢量是無氮源添加的1.11～2.07、1.25～57.64 倍。

相同條件下，SMF2 菌絲生長較快，而哈茨木霉T39 產孢能力更高。 35 ℃、pH 值為7 時最利于SMF2 產孢，而30 ℃、pH 值為6 時最利于T39產孢。 人工擴繁時，可通過調節環境溫度和培養基酸堿度調控SMF2、T39 的產孢情況；有機氮和單糖更有利于SMF2 和T39 菌絲生長和孢子形成。