蒙古口蘑交配型鑒定分析*

劉曉婷，郭九峰**，王淑妍，孫國琴，李亞嬌，那 日

（1.內蒙古大學物理科學與技術學院離子束生物工程自治區重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010021；2.內蒙古農牧業科學院蔬菜研究所，內蒙古 呼和浩特 010031）

〈育種與馴化〉

蒙古口蘑交配型鑒定分析*

劉曉婷1，郭九峰1**，王淑妍1，孫國琴2，李亞嬌2，那 日1

（1.內蒙古大學物理科學與技術學院離子束生物工程自治區重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010021；2.內蒙古農牧業科學院蔬菜研究所，內蒙古 呼和浩特 010031）

對3株野生蒙古口蘑Tricholoma mongolicum Imai.子實體進行擔孢子收集，采用單孢稀釋法分離鑒定得到300株蒙古口蘑單孢菌絲體，利用三輪交配法對其中101株進行交配型鑒定，試驗統計結果進行χ2檢驗，并對4種不同交配型的單核菌株進行ISSR分子標記驗證。結果顯示，可觀察到典型的4種交配反應菌落形態并可用ISSR分子標記技術加以區分驗證。所得蒙古口蘑交配類型屬于四極性交配系統，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制。

蒙古口蘑；單核菌絲；三輪交配法；ISSR；交配類型

蒙古口蘑 （Tricholoma mongolicum Imai.）[1]為我國北方草原上生長的優質野生食用菌，在內蒙古地區，尤以錫林郭勒盟產出的蘑菇最為人喜愛，又名草原口蘑、白蘑菇[2]、白（口）蘑、蒙古白麗蘑等，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 擔子菌綱（Basidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 口蘑屬（Tricholoma） 或白麗蘑屬（Leucocalocybe）[3-4]，其子實體中等大，菌蓋直徑5 cm～17 cm，白色且光滑，半球狀至平展，初期邊緣內卷，菌褶白色稠密、不等長，菌柄白色且粗壯，基部稍膨大，菌肉肥厚，具香氣味，是當地牧民祖祖輩輩都喜愛的傳統美食[5-6]。其富含人體所需必需氨基酸，營養豐富且均衡，又具藥用價值，能起到一定的抗癌作用，可輔助治療病毒性疾病，提高人體免疫力，較好地預防骨質疏松癥等[7-9]。據當地的牧民們講，在二十多年以前，夏秋季節常出現蒙古口蘑蘑菇圈現象。但現如今受各種因素影響，蒙古口蘑生態環境遭受較為嚴重的破壞，其資源也越來越少，目前已被列入《國家重點保護野生植物名錄（第二批）》。自1992年田紹義[10]在《真菌學報》上第1次報道成功馴化栽培蒙古口蘑后，國內外再沒有報道顯示有其馴化成功的情況。截至日前，蒙古口蘑人工栽培也未取得相關研究進展。

交配類型是遺傳學問題中較為基礎且重點的研究對象，為食（藥）用菌遺傳育種的相關研究提供基礎性資料[11-12]。近些年，食（藥）用菌遺傳育種的探索愈加深入[13-15]，而基礎性生物學的試驗研究卻少見報道，更未見蒙古口蘑交配型系統鑒定的試驗報道。探明蒙古口蘑的交配型系統，旨在為進一步研究蒙古口蘑交配型基因等其他功能基因提供相應的參考，以期指導蒙古口蘑的遺傳育種研究工作，為研究草原珍稀食用菌的遺傳學及生物學習性，加速其馴化和育種研究等提供基礎依據，為野生食（藥）菌的開發和市場化生產提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用蒙古口蘑子實體采自內蒙古錫林郭勒盟白音錫勒草原，為蒙古口蘑核心生長區。

1.2 培養基、主要試劑與儀器

MS＋平板培養基：市購MS培養基，另外加1.5 g·L-1酵母浸出粉和1.5 g·L-1酸水解酪蛋白，自然pH[16]；齊氏（Ziehl）石炭酸復紅染液、Taq PCR Master Mix等；OLYMPUS光學顯微鏡、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統儀等。

1.3 擔孢子的收集和單核體分離

分子鑒定：取少量口蘑組織，提取DNA，用真菌18S rRNA和ITS4通用引物進行PCR擴增，結果見參考文獻[16]。

分別將編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的3個新鮮成熟的蒙古口蘑子實體用小刀削去少許菌柄，在超凈工作臺上用75%的酒精擦拭菇體表面進行消毒，再用無菌水快速沖洗菇體表面3次，用滅菌的吸水紙將菇體表面水分盡量吸干。采用常規孢子彈射法收集擔孢子，收集得到的孢子印低溫密封保存備用。

采用常規單孢稀釋法制備孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數板挑選稀釋至100 μL含40個～60個擔孢子的稀釋度，作為該試驗的擔孢子懸液，涂布平板，25℃避光培養。培養后跟蹤觀察，待孢子萌發形成肉眼可見微小菌落時，立刻挑取單菌落分別轉移至新的MS＋平板培養基上進行插片培養[17]。

1.4 單孢萌發菌株的鑒定

一段時間后，上述新的MS＋平板上的菌落長大且延伸生長到蓋玻片上后，直接取出制作玻片，以齊氏（Ziehl）石炭酸復紅染液染色1 min～2 min后，鏡檢，無鎖狀聯合者判定為單核菌絲。挑選300株單核菌絲，順序編號，人工氣候室避光培養備用。

1.5 單核體雜交和雙核體檢出

分別對供試單核體菌落取直徑0.6 cm的圓塊，在新的培養基上距離2 cm接種2個單核體培養塊，約20 d兩單核菌絲體接觸后，繼續培養4 d～6 d，觀察交接區菌絲體生長情況和菌落形態，并制片鏡檢，以鎖狀聯合情況判斷雙核體情況。

1.6 交配型鑒定試驗

三輪交配[18]試驗：收集的孢子經培養后鑒定出來的單核菌絲體中，隨機取出101個，順序編號為Ⅰ1～Ⅰ101。第1輪：從101株單核菌絲體中隨機選1株作為T1，T1與其余100株單核菌絲體分別交配，經檢驗，隨機挑選1株與T1發生親和的設T2；第2輪：將T2與上輪與T1不親和的菌株分別配對，經檢驗，隨機挑選1株與T2不親和的設為T3；第3輪：將T3與上一輪中其余菌株分別配對，經檢驗，隨機挑選1一株與T3親和的設為T4。根據“親和”、“平貼”、“柵欄”等菌落形態觀察和鏡檢有無鎖狀聯合來統計各輪各種反應數量，并推斷每組的交配型，確定蒙古口蘑交配類型。重復3次（編號Ⅰ～Ⅲ）。

1.7 交配型實得比例的χ2檢驗

卡方檢驗上述試驗結果，公式為：

式中：Oi即每種交配數的實際觀測值；Ei即固定交配類型下每種交配數的理論值。

1.8 蒙古口蘑不同交配型ISSR分子鑒定

以蒙古口蘑單核菌絲體DNA為模板，設計并篩選ISSR引物，從分子水平上對不同交配基因型蒙古口蘑單核菌株進行分類。

20 μL PCR 反應體系：10 μL 2×Taq PCR Master Mix、1 μL引物（10 pmol·μL-1）、1 μL DNA模板、8 μLddH2O。

PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1 min，共38個循環；72℃繼續延伸10 min。4℃保存。

電泳條件：1.5%瓊脂糖凝膠，恒壓100 V，30 min。

2 結果與分析

2.1 單核菌絲的鑒別與形態觀察

單核菌絲在光學顯微鏡油鏡下（1 000×）鏡檢，無鎖狀聯合者為單核菌絲。

2.2 蒙古口蘑擔孢子交配類型鑒定結果

采用三輪交配法，第1次試驗：第1輪選T1為Ⅰ1，Ⅰ1與其余100株單核菌絲體交配，共100個試驗皿，經檢驗，其中與Ⅰ1發生親和菌株個數為37個，從中隨機挑選Ⅰ52設為T2；第2輪將T2與上一輪與Ⅰ1不親和的63個菌株交配，經檢驗，其中與Ⅰ52發生親和菌株個數為23個，不親和的40個，從與中隨機挑選Ⅰ6設為T3；第3輪將T3與上一輪中與Ⅰ52不親和的其余39個菌株交配，經檢驗，與Ⅰ6發生親和反應的菌株個數為10個，從中隨機挑選Ⅰ63設為 T4。

在進行本次交配反應時，可以明顯觀察到有4種基本的菌落反應形態，見圖1。親和反應，兩菌株菌落交界處，菌落形態明顯不同，常表現為高聳，而且白色加深，菌絲凝結很難挑取（圖1A）；柵欄反應，兩菌株菌落屬于不親和反應，各自生長，在交界處形成明顯的“溝壑”，此處無菌絲體生長，且兩菌落在近交界處表現為明顯的相互抑制（圖1B）；平貼反應，兩菌株菌落屬于不親和反應，各自生長，在交接處沒有明顯的“柵欄”，而是有“平貼”現象，這種不親和可能也是1種相互抑制的生長（圖1C）；無交界的不親和反應，兩菌株菌落也屬于不親和反應，各自生長，兩菌落交接處既不形成形態不同的親和菌絲體，也不形成“溝壑”或“平貼”的抑制反應，而是互不影響，最終兩菌落全部長到一起，難分彼此（圖1D）。

統計4種反應數量，比值大約為1:1:1:1，可初步判定蒙古口蘑屬四極性交配系統。根據四極性交配反應原理，親和反應為基因型AxBy×AyBx的兩株菌株交配，柵欄反應為基因型AxBx×AyBx的兩株菌株交配，平貼反應為基因型AxBx×AxBy的兩株菌株交配，無交界不親和反應為基因型AxBx×AxBx的兩株菌株交配（x=1或2；y=1或2）。可推斷本次試驗的T1、T2、T3、T4的交配基因型：若設T1交配型為A1B1，則 T2交配型為 A2B2，則 T3交配型為 A1B2或 A2B1，若T3交配型為A1B2，則T4交配型為A2B1，若T3交配型為A2B1，則T4交配型為A1B2。

圖1 四種交配反應菌落形態Fig.1 Colony morphology of four mating reactions

2.3 交配型實得比例的χ2檢驗結果

三輪交配情況（3次重復試驗）見表1。

以第1次試驗第1輪反應為例，將4種交配型基因對應的反應數卡方檢驗：

χ2=(37-25)2/25+(24-25)2/25+(20-25)2/25+(19-25)2/25=7.078，P待測=7.078

自由度n=3時，查χ2表知P0.050=7.81＞7.078，所以P待測＞0.05，代表實測值與理論值差異不顯著，即蒙古口蘑4種擔孢子單核菌株的比例符合1∶1∶1∶1，A、B因子在減數分裂時自由組合，這一結果表明蒙古口蘑交配類型屬于四極性交配系統，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制系統。

2.4 ISSR分子鑒定結果

以上述結果中第1次試驗篩選出的4種不同交配型單核菌株Ⅰ1、Ⅰ52、Ⅰ6和Ⅰ63的DNA為模板，以 13號引物 （5’-3’）：GAGAGAGAGAGAGA GATG，做PCR擴增，電泳結果見圖2。

從圖3可以看出，4種不同交配型單核菌株Ⅰ1、Ⅰ52、Ⅰ6和Ⅰ63的隨機擴增產物，從條帶數量與位置均有不同，再次從分子角度進一步驗證有4種不同基因型的試驗結果。

3 結論與討論

3.1 結論

表1 重復試驗三輪交配情況Tab.1 Mating situation of repeated tests

圖2 蒙古口蘑單核菌絲體ISSR-PCR結果Fig.2 ISSR-PCR result of primary hypha of Tricholoma mongolicum

通過上述結果，可得出以下幾點結論。

蒙古口蘑單核菌絲交配時，可以觀察到典型的4種交配反應：親和反應、柵欄反應、平貼反應、無交界不親和反應；含不同交配型基因的蒙古口蘑單核菌絲體可用ISSR分子標記技術加以區分和驗證；所得蒙古口蘑交配類型屬于四極性交配系統，為A、B因子互不連鎖的雙因子控制系統。

3.2 討論

傳統的真菌交配型鑒定方法為單核菌株兩兩之間進行交配，僅一輪統計交配反應類型和數量，便可推斷交配類型，但這樣組合數量巨大，如101株單核菌株兩兩之間互相交配，有5 050個組合（C2101=5050）。而三輪交配法[18]以兩兩交配的原理為基礎，通過每一輪交配選出同類型反應，有效降低試驗數量，大幅度降低工作量，同時，與原生質體雜交的鑒定方法相比，該方法也具有操作簡單的明顯優勢，加之三輪交配法建立在統計學的原理之上，試驗結果可靠，故本試驗選擇該方法對蒙古口蘑交配型進行鑒定分析。

另外，試驗中兩菌株交配反應的菌落表現，可以大致區分出反應類型，如親和反應在交界處有明顯的不同菌絲體形態，不親和反應在交界處有明顯的互相抑制生長的菌落形態。但在實際操作過程中，一定要結合光學顯微鏡檢查是否有鎖狀聯合去判斷反應是否為親和，一方面為了再一次確定表現明顯的反應，另一方面為了驗證一些表現不明顯的或無代表性表型[19]的交配反應類型，確保試驗的準確性。

ISSR技術已廣泛應用于食用菌遺傳育種方面[20-21]。該技術能從分子水平揭示出菌株間的遺傳差異、親緣關系及篩選與待測基因緊密連鎖的基因片段，為育種時選育親本原料提供具有針對性、準確的遺傳信息，有利于選育出產量高、品質好的優良品種。目前，ISSR分子標記技術在國內食用菌交配型分析、遺傳多樣性及育種方面已有大量報道[22-23]。本文驗證了ISSR技術可對蒙古口蘑單核菌絲加以區分并進行分類，若將大量的蒙古口蘑單核菌絲進行ISSR分子標記，可分類后統計每類數量，進行蒙古口蘑4種擔孢子單核菌株比例1∶1∶1∶1，以及A、B因子在減數分裂時自由組合的驗證。故將其與三輪交配法配合使用，可進一步增加試驗結果的可信度。

綜上，本文利用經典的三輪交配法對野生珍稀食（藥）用菌蒙古口蘑進行了交配型鑒定分析，確定了蒙古口蘑的交配類型屬于四極性交配系統，并驗證了ISSR分子標記技術可結合三輪交配法應用于蒙古口蘑單核菌絲的分類與交配型鑒定，為日后對蒙古口蘑遺傳育種、人工馴化與栽培的相關研究提供資料，為其市場化開發與利用奠定基礎。

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注：不同意上述轉讓聲明的著作權人，在收到論文刊用通知5日內書面回復《中國食用菌》編輯部。

Identification for Mating Type of Tricholoma mongolicum

LIU Xiao-ting1,GUO Jiu-feng1,WANG Shu-yan1,SUN Guo-qin2,LI Ya-jiao2,NA Ri1
（1.Key Laboratory of Ion Beam Biotechnology,College of Physical Science and Technology,Inner Mongolia University,Huhhot 010021,China;2.Institute of vegetables,Inner Mongolia Academy of Agriculture and Livestock Sciences,Hohhot 010031,China）

This study is to identificate for mating type of Tricholoma mongolicum by three rounds of mating method.We first collected the basidiospores of three strains of wild T.mongolicum,and 300 strains of mononuclear myceliums were obtained by single spore dilution method.Then the mating type on the 101 strains were tested and the chi-square test to the results were made.It was verified the four different mating type of mononuclear myceliums by ISSR molecular markers.The results showed that edible fungi of T.mongolicum belonged to the typical tetrapolar heterothallic mating system.It can be observed typical four mating reactions of their colony morphology and can be used ISSR molecular markers to distinguish validation.

Tricholoma mongolicum;mononuclear mycelium;three rounds of mating method;ISSR;mating type

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0018-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.004

國家自然科學基金（No.51267014）。

劉曉婷（1991-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為環境生物物理。E-mail:liuxiaoting0522＠sina.com

**通信作者：郭九峰（1964-），男，博士，教授，主要從事生物物理與生物技術研究。E-mail:guojf101＠sina.com

2017-09-20