改良抗酸染色和結核與非結核基因檢測在結核病病理診斷中的應用比較

彭海英　曾江　張潤蘭　陳芮　賴小菊

【摘要】? 目的? ? 比較分析改良抗酸染色和結核與非結核基因檢測在結核病病理診斷中的差異。方法? ? 收集贛州市第五人民醫(yī)院2020年1—12月確診肺結核患者96例，組織經(jīng)病理常規(guī)取材、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，之后進行改良抗酸染色與結核與非結核基因檢測。結果? ? 96例肺結核患者病理中，抗酸染色陽性例數(shù)48例，陽性率50%；結核與非結核基因檢測結核陽性例數(shù)70例，陽性率73%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩種方法聯(lián)合檢測陽性例數(shù)75例，陽性率78%，與基因檢測相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與改良抗酸染色相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論? ? 在結核病病理診斷中，結核與非結核基因檢測陽性率顯著高于改良抗酸染色法，兩種方法聯(lián)合檢測更有利于提高確診率。

【關鍵詞】? 結核； 病理診斷； 改良抗酸染色； 結核與非結核基因檢測

Application comparison of modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosisPeng Haiying，Zeng Jiang，Zhang Runlan，Chen Rui，Lai Xiaoju.The Fifth People's Hospital of Ganzhou City，Ganzhou，Jiangxi? 341000

【Abstract】? Objective? ? To compare and analyze the differences between modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosis.Methods? ? A total of 96 cases of patients with pulmonary tuberculosis diagnosed in Ganzhou Fifth People's Hospital from January 2020 to December 2020 were collected. The tissues were routinely collected by pathology， embedded in paraffin， sectioned， and stained with HE， and then subjected to improved acid-fast staining and comparison of tuberculosis and non-tuberculosis genetic testing.Results? ? Among the 96 cases of pulmonary tuberculosis patients， 48 were positive for acid-fast staining， with a positive rate of 50%. Tuberculosis and non-tuberculous genetic testing were 70 positive for tuberculosis， with a positive rate of 73%. Compared with the two methods， The positive rate of tuberculosis and non-tuberculosis gene detection was significantly higher than that of the modified acid-fast staining method， and the difference was statistically significant； the number of positive cases detected by the two methods was 75， and the positive rate was 78%. Compared with the genetic test， the difference was not statistically significant. Compared with staining， the difference is statistically significant.Conclusion? ? Among the two detection methods for pathological diagnosis of tuberculosis， the positive rate of tuberculosis and non-tuberculous gene detection is significantly higher than that of the modified acid-fast staining method. The combined detection of the two methods is more conducive to clinical diagnosis，worthy of clinical promotion.

【Key Words】? Tuberculosis； Pathological diagnosis； Modified acid fast staining； Tuberculosis and non-tuberculous gene detection

中圖分類號：R378.91? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）20-0075-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.20.025

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染性疾病，是全球單一病原體感染導致死亡的第九大原因，嚴重危害人類健康，是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。尤其是近年來由于人類免疫缺陷病毒（HIV） 感染、空氣污染等因素影響，發(fā)病率逐年增高。因此，結核病患者的早期診斷和治療，已成為我國傳染病防治的重要工作[1]。病理診斷方面，典型的結核病變?yōu)橛筛衫覙訅乃馈㈩惿掀蛹毎屠矢駶h斯細胞形成的結核樣壞死性肉芽腫，顯微鏡下容易識別，但由于抗生素濫用、HIV感染、環(huán)境污染等因素引起結核桿菌變異，使結核病變組織形態(tài)學不典型[2]。因此，對于結核病的診斷，尤其是病理形態(tài)不典型的結核診斷來說，在石蠟組織切片中找到結核桿菌具有重要意義。而結核與非結核基因檢測能從分子水平檢測出組織中的結核與非結核分枝桿菌，技術上十分先進和成熟。本文旨在分析改良抗酸染色和結核與非結核基因檢測在結核病病理診斷中的差異，從而為臨床結核病的有效診斷提供參考。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 研究對象? ? 收集贛州市第五人民醫(yī)院2020年1—12月確診為肺結核患者96例，所有病理組織標本均經(jīng)4%中性甲醛固定5～6 h，病理常規(guī)取材、脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，之后進行改良抗酸染色和結核與非結核基因檢測。

1.2? ? 方法

1.2.1? ? 改良抗酸染色? ? 染色試劑為珠海貝索的抗酸染色試劑套盒，組織切片經(jīng)脫蠟后不經(jīng)酒精入流水稍沖洗；用吸水紙抹去切片周圍液體至切片稍濕潤；流水沖洗2 min；0.3% TritonX-100 液處理10 min，流水沖洗2 min；石炭酸復紅溶液室溫下染色20～30 min；流水洗去多余染液；滴加酸性酒精溶液分化3～4次，至切片呈無色為止；流水沖洗2 min，加亞甲基藍溶液染20～30 s，流水沖洗2 min，晾干、封片。于顯微鏡下進行結果判讀： 抗酸染色陽性分枝桿菌鏡下一般呈紅色、兩端鈍圓稍彎曲的桿狀，有時呈串珠狀，長1～4μm，可散在或呈片狀分布，細胞核及背景呈淡藍色。見封三圖1—圖2。

1.2.2? ? 結核與非結核基因檢測? ? 檢測試劑盒為成都博奧晶芯生物有限公司的分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。（1）組織連續(xù)切片15～20片后，置于離心管中。（2）溶蠟處理后，加入4倍體積4% NaOH液化。（3）30 min后吸取液化后的樣本1 mL置EP管內(nèi)，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。（4）加入1 mL洗液于EP管中，充分渦旋震蕩后12 000 r/min離心5 min，棄上清液。（5）加入50 μL核酸提取液，充分渦旋震蕩后，將液體與沉淀轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，置入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速震蕩10 min。（6）將核酸提取管轉(zhuǎn)至95 ℃水浴鍋中放置加熱5 min，12 000 r/min離心1 min，取上清液進行擴增反應。樣本檢測時均設陽性對照和陰性對照。同時選擇FAM通道和HEX通道，熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。擴增過程中儀器實時檢測熒光信號并分析增長曲線。結果分析：試劑盒的參考值為40，樣本擴增曲線呈S形，且Ct值小于40的樣本，判定為陽性；擴增曲線不呈S形或Ct值為40（或無任何數(shù)值）判定為陰性。

1.3? ? 統(tǒng)計學方法? ? 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分比表示，行χ²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? ? 結果

2.1? ? 臨床病理學特征? ? 96例肺結核患者中男性57例，女性39例，年齡為15～84歲，其中肺內(nèi)結核患者58例（60%），胸膜結核患者18例（19%），肺及胸膜外結核患者20例（21%）；鏡下表現(xiàn)為壞死性炎改變者38例，肉芽腫性炎改變者58例。

2.2? ? 改良抗酸染色與結核與非結核基因檢測結果比較? ? 96例肺結核患者病理中，抗酸染色陽性例數(shù)48例，陽性率為50%；結核與非結核基因檢測結核陽性例數(shù)70例，陽性率為73%，差異有統(tǒng)計學意義（χ²=10.642，P=0.001）。兩種方法聯(lián)合檢測陽性例數(shù)75例，陽性率78%，與基因檢測法相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ²=0.704，P=0.401），與抗酸染色法相比，差異有統(tǒng)計學意義（χ²=16.492，P<0.001），見表1。

3? ? 討論

結核病是由結核分枝桿菌復合群感染引起的一種世界范圍內(nèi)流行的傳染性疾病，嚴重危害人類健康。2021年10月14日世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布了《2021年全球結核病報告》[3]，報告中指出，全球結核潛伏感染人群近20億，2020年，全球新發(fā)結核病患者987萬，發(fā)病率為127/10萬。2020年我國估算的結核病新發(fā)病例數(shù)為84.2萬，結核病發(fā)病率為59/10萬，我國估算結核病發(fā)病數(shù)在30個結核病高負擔國家中排第2位，僅次于印度（259萬），結核病死亡率為2.1/10萬。雖然近年來我國結核病發(fā)病率和死亡率有所下降，但因感染人群基數(shù)大、醫(yī)療設施缺乏以及其他社會因素的限制，中國結核病的防控工作仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，早期、快速、準確診斷是結核防治的關鍵。近年來，結核病的實驗室診斷技術經(jīng)過不斷創(chuàng)新取得了較大的進展，尤其是分子檢測技術的應用更是帶來了革新。

結核感染可累及全身多個臟器，其中以肺最為常見。結核病常見的實驗室診斷方法包括抗酸染色涂片鏡檢法、結核菌素試驗、干擾素釋放試驗、結核分枝桿菌培養(yǎng)以及結核分子檢測等[4]。而病理學作為一種診斷結核病的重要途徑，尤其在菌陰肺結核及肺外結核等疑難病例診斷中起到了重要作用。結核分枝桿菌引起的慢性炎癥為一種特異性感染，可引起Ⅱ型變態(tài)反應和Ⅳ型變態(tài)反應，表現(xiàn)為炎癥的3種基本病理變化：滲出、壞死和增生，可以同時存在，或以某一種改變?yōu)橹鳎医?jīng)常相互轉(zhuǎn)化[5]。結核病的組織學鏡下特點為上皮樣肉芽腫性炎，在顯微鏡下表現(xiàn)為大小不等和數(shù)量不同的結節(jié)性肉芽腫。典型的結核結節(jié)中央見干酪樣壞死，壞死周圍可見上皮樣細胞和（或）朗格漢斯巨細胞，外周有增生的纖維結締組織和慢性炎細胞浸潤，有時亦可見缺少肉芽腫病變的干酪樣壞死結節(jié)[5-6]。在本次研究的96例樣本中，表現(xiàn)為肉芽腫性炎的病例為58例（60.4%），而僅表現(xiàn)為干酪樣壞死的病例38例（39.6%）。然而，除結核感染外，肉芽腫性病變也可出現(xiàn)在其他一些感染性疾病或非感染性疾病，如非結核分枝桿菌感染、真菌病、結節(jié)病、肉芽腫性血管炎等，需通過其他方法進行鑒別[6-7]。

抗酸染色法作為結核分枝桿菌的主要檢測方法，其快速、簡易、價廉，深得各實驗室的推崇。本實驗室所采用的改良抗酸染色，石蠟切片厚度為6μm，既可以增加切片中菌體的含量，又能清晰觀察抗酸桿菌的形態(tài)；染色之前采用TritonX-100進行打孔處理，增加了細胞壁對染色劑的通透性，提高染液的滲透率，使胞內(nèi)菌更好地進行著色，提高了敏感性和檢出率[8]。本研究抗酸染色陽性例數(shù)為48例，抗酸陽性桿菌主要存在于組織的壞死區(qū)域或壞死與上皮樣肉芽腫的交界處。然而，除結核分枝桿菌外，還有非結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、部分努卡菌和軍團菌屬也可顯示抗酸染色陽性[6]，仍需進一步進行鑒別。

近年來，隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，建立在核酸擴增基礎上的分子病理檢測技術已經(jīng)獲得WHO的認可，結核分枝桿菌的分子檢測技術也日益先進，結核與非結核分枝桿菌檢測由此而生。相對于其他方法而言，分子檢測具有簡單、快速、敏感、特異等優(yōu)點，可有效提高組織樣本中結核分枝桿菌檢出率[9]。利用聚合酶鏈反應（PCR）檢測技術對石蠟包埋組織中的結核分枝桿菌DNA進行檢測，并通過與其他抗酸桿菌的鑒別，特別是在一些陳舊性病變，其結核病理形態(tài)學不典型，僅表現(xiàn)為凝固性壞死或纖維增生性病變，抗酸染色難以查找到抗酸桿菌。采用PCR檢測方法對結核桿菌進行檢測，鑒別診斷出結核與非結核分枝桿菌，實現(xiàn)結核病的精準診斷[5]。當然，由于部分標本含菌量較低，活檢組織前期處理不當導致DNA降解、分子檢測操作時NaOH消化時間過長發(fā)生RNA降解，以及組織經(jīng)常規(guī)HE和其他檢測損失較多等，均會影響結核分枝桿菌的基因檢測結果，因此需要專業(yè)人員進行操作，以減少組織損耗，提高陽性率[3，10]。

值得指出的是，作為結核與非結核分枝桿菌核酸檢測的補充——基因芯片法，提供了利福平和異煙肼的耐藥性檢測以及非結核分枝桿菌菌種鑒定。基因芯片技術于20世紀90年代開始應用于結核病的診斷。其將大量探針固定于特殊載體上，之后與待測樣本的核酸進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度而獲取樣本分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片法具有高通量、快速、靈敏度高、準確等特點，可以進行非結核分枝桿菌菌種鑒定以及結核分枝桿菌的耐利福平基因 rpoB和耐異煙肼 kat G、inhA 基因常見突變位點檢測，為臨床快速診斷分枝桿菌感染、指導臨床用藥提供可靠依據(jù)[11-12]。

綜上所述，改良抗酸染色法操作簡單、快速、價廉，一直為結核病診斷最常規(guī)的檢測方法；而結核與非結核基因檢測重復性好、結果可靠，敏感度高，能鑒別出結核與非結核分枝桿菌感染，在此基礎上進行結核耐藥性檢測以及非結核分枝桿菌菌種鑒定。因此，基于顯微鏡鏡下形態(tài)學的典型結核改變，借助于抗酸染色法和結核與非結核基因檢測病原學證據(jù)的應用，可能是結核病病理診斷的模式之一，為臨床結核病的診斷和指導用藥提供重要參考依據(jù)。

參考文獻

[1]? ? 林曉.抗酸染色與熒光定量PCR檢測在石蠟組織結核病病理診斷中的比較[J].臨床與實驗病理學雜志，2019，35（3）：356-357.

[2]? ? 張繼偉，李欽麗，聶秀.石蠟包埋組織結核分枝桿菌檢測方法的對比分析[J].臨床與實驗病理學雜志，2021，37（3）：362-365.

[3]? ? 盧春容，房宏霞，陸普選，等.WHO 2021年全球結核病報告：全球與中國關鍵數(shù)據(jù)分析[J/CD].新發(fā)傳染病電子雜志，2021，6（4）：368-372.

[4]? ? 曾江，肖南昌，彭海英.HIV/AIDS合并菌陰肺結核患者T-SPOT.TB與結核抗體的診斷價值比較[J].實驗與檢驗醫(yī)學雜志，2018，36（2）：199-200.

[5]? ? 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.WS 288—2017肺結核診斷標準[S].北京：中國標準出版社，2017.

[6]? ? 王恩華，張杰.臨床病理診斷與鑒別診斷——氣管、肺、胸膜及縱隔疾病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：402.

[7]? ? 李雪，孟禹彤，周翔，等.結核病病理診斷的新方法研究[J].診斷病理學雜志，2020，27（5）：300-305.

[8]? ? 曾江，彭海英，朱俊芳.沉降式制片技術與改良抗酸染色應用于腦脊液找抗酸桿菌的分析[J].基層醫(yī)學論壇，2018，22（4）：525-526.

[9]? ? 李俊明，徐煒.結核病的分子診斷——進展與挑戰(zhàn)[J].實驗與檢驗醫(yī)學雜志，2020，38（6）：1039-1046.

[10]? ? 岳永寧，范大鵬，張艷，等.三種結核分枝桿菌分子檢測技術診斷肺結核比較[J].預防醫(yī)學，2019，31（5）：537-540.

[11]? ? 何珍，王璞.結核實驗室診斷技術研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2018，34（21）：3336-3339.

[12]? ? 冉兵，蔡林.基因芯片檢測耐利福平結核分枝桿菌準確性的Meta分析[J].中國防癆雜志，2015，37（1）：56-65.

（收稿日期：2023-04-14）