石榴皮瓤提取物對成年小鼠體重增長及血漿免疫相關指標的影響

劉佳佳,韓 濤

(1.新疆畜牧科學院畜牧研究所,烏魯木齊 830011;2.新疆畜牧科學院獸醫研究所,烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】石榴營養價值豐富,包括維生素、蛋白質、脂肪以及多種微量元素,且石榴皮瓤提取物含有大量的多酚類化合物。鞣花酸(Ellagic acid)是一種分布在石榴皮瓤中的多酚類化合物,其生物學功能體現在機體抗氧化和抗炎癥作用[1]。【前人研究進展】研究表明[2],多酚類化合物可以改善動物健康。Amor Antonio J等[3]研究顯示,鞣花酸具有顯著的抗氧化作用,能夠減緩機體衰老。Hassan Fawzia A等[4]研究表明,石榴皮瓤提取物具有抗氧化和免疫調節的作用,可以提高機體免疫功能,有利于動物健康,且石榴皮瓤提取物是很有前景的天然抗氧化劑的來源。【本研究切入點】石榴皮瓤提取物與飼料中抗生素類添加劑相比沒有副作用,且一定程度上能夠提高動物生長性能和增強免疫力[5]。尚需研究石榴皮瓤提取物對小鼠體重、血漿抗氧化和促炎因子水平的影響。【擬解決的關鍵問題】以成年小鼠為研究對象,灌喂石榴皮瓤提取物,研究石榴皮瓤提取物對小鼠體重增長及氧化應激相關指標的影響,為研究鞣花酸調控機體抗氧化和抗炎的機制及生物學作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗選擇平均日齡50 d、體重相近(37.31±5.57)g、健康良好的SPF級雄性昆明小鼠30只,購自新疆醫科大學。

在第21 d,所有試驗小鼠斷尾采血,將血樣收集于肝素鈉抗凝管內,室溫靜置10 min后3 500 r/min離心15 min,吸取上清,-20℃冷凍保存。同一個重復組3只小鼠的樣品合為1個樣品,即每個組最終5個樣品,用于后續指標的測定。

1.2 方 法

1.2.1 石榴皮瓤中鞣花酸提取

在市場上購買新疆和田皮亞曼新鮮石榴,石榴去除籽實后剩余的皮瓤晾干后超微粉碎,用于提取鞣花酸。鞣花酸提取參考陳鵬等[6]方法。

1.2.2 試驗設計

將試驗小鼠,隨機分為2組,分別為對照組和試驗組,每組5個重復,每個重復3只,共15只。在相同基礎日糧條件下試驗組小鼠灌喂1.5 g/(d·只)石榴皮瓤粗提物[即鞣花酸的灌喂量為40.74 mg/(d·只)],將1.5 g提取物溶解于2 mL無菌蒸餾水中,分別在每天10:00和18:00分兩次灌喂,每次灌喂1 mL,對照組每次灌喂等體積的無菌蒸餾水,進行為期21 d的灌喂試驗。每周測定1次小鼠的平均采食量,試驗結束當天小鼠晨飼前空腹稱量體重,尾部采集小鼠血樣并制取血漿,-20℃冷凍保存,待測。表1

表1 日糧組成及營養水平(以風干物質計,%)

1.2.3 測定鞣花酸含量

鞣花酸測定的色譜分析條件:色譜柱為C18(Welch Ultimate AQ-C18,4.6×250 mm,5 μm);流動相的配制:分別量取甲醇∶水∶冰乙酸按50∶49.85∶0.15(V/V/V)的比例混合,用0.45 μm濾膜抽濾,超聲脫氣30 min;檢測波長:254 nm,柱溫:35℃;進樣量:20 μL。鞣花酸的平均含量為(27.16±5.26) mg/g(風干重)。

1.2.4 測定指標

常規指標:總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)和尿素氮(BUN);抗氧化相關指標:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-PX)、抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子活力、總抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA);炎癥因子相關指標:腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-17(IL-17A)和白細胞介素-10(IL-10)。所有指標檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,方法參考試劑盒提供的方法。

1.3 數據處理

在Excel中先將數據預處理,再使用SPSS19.0軟件進行獨立樣本T檢驗,試驗數據均以平均數±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 石榴皮瓤中鞣花酸含量的測定

研究表明,石榴皮瓤中提取的鞣花酸平均含量為(27.16±5.26) mg/g(風干重),自然風干基礎上鞣花酸的有效含量為2.72%。

2.2 石榴皮瓤提取物對小鼠體重增長影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物對小鼠日均采食量和初始重均無顯著影響(P>0.05)。能夠顯著提高試驗組小鼠末重、總增重及平均日增重,分別比對照組提高了8.21%(P<0.05)、47.56%(P<0.05)和48.39%(P<0.05)。表2

表2 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠體重增長變化(n=15)

2.3 石榴皮瓤提取物對小鼠血漿常規指標影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物對小鼠血漿中總蛋白、白蛋白、球蛋白以及尿素氮均無顯著影響(P>0.05),但能提高血漿中總蛋白、白蛋白和球蛋白含量,能夠降低血漿中尿素氮的含量,比對照組低了33.48%(P>0.05)。表3

表3 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血漿常規指標變化(n=15)

2.4 石榴皮瓤提取物對小鼠血漿抗氧化水平影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物能夠顯著提高試驗組小鼠血漿SOD、CAT和T-AOC的水平,分別比對照組提高了24.44%(P<0.05)、54.82%(P<0.05)和27.69%(P<0.05),對GSH-PX活力無顯著性影響(P>0.05);極顯著提高了試驗組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活力,分別比對照組提高了36.01%(P<0.01)和43.21%(P<0.01);顯著降低了試驗組小鼠血漿MDA的濃度,比對照組降低了25.82%(P<0.05);能夠提高血漿中NO的水平,但差異不顯著(P>0.05)。表4

表4 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血漿抗氧化水平變化(n=15)

2.5 對血漿炎癥因子水平影響

研究表明,石榴皮瓤提取物能夠顯著降低試驗組小鼠血漿中TNF-α和IL-17A的水平,分別比對照組降低了17.16%(P<0.05)和30.34%(P<0.05);對IL-10的水平無顯著性影響(P>0.05)。表5

表5 石榴皮瓤提取物下小鼠血漿炎癥相關指標水平變化(n=15)

3 討 論

3.1鞣花酸是一種天然多酚類化合物,廣泛存在于各種堅果、軟果等植物組織(如草莓、覆盆子、黑莓、石榴、葡萄、核桃)中[7]。鞣花酸通常與葡萄糖等縮合成糖苷,進而參與鞣花單寧酚類化合物的形成,進入動物體內后先水解形成鞣花酸,大部分被腸道微生物代謝為尿石素[8]。鞣花酸具有廣泛的生物學作用,包括抗氧化、抗腫瘤、抗突變及抗炎等[9]。補喂鞣花酸能夠促進動物生長發育,與鞣花酸能夠改善機體消化機能、促進腸道健康有關[10-11]。趙銘偉等[12]研究顯示,仔豬基礎日糧中添加鞣花酸(500 g/d),能夠顯著促進仔豬的體重增長。陳暉等[13]研究顯示,灌喂石榴汁使SD大鼠體重和日增重比對照組提高了8.88%和36.32%(P<0.05)。試驗中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,能夠顯著提高試驗組小鼠末重、總增重及平均日增重,與趙銘偉等[12]和陳暉等[13]研究結果一致,鞣花酸對促進機體生長發育方面具有一定作用。體重的增加是因為日糧中蛋白質沉積率提高,還是改變了生長發育相關基因表達量及激素的水平所致,有待于進一步研究。

3.2血漿白蛋白作為營養物質的載體,可維持機體滲透壓[14];血漿球蛋白由漿細胞分泌,具有增強機體免疫力、防止病毒和細菌入侵等作用[15]。周本宏等[16]研究發現,石榴皮鞣質對阿霉素腎病大鼠的腎臟具有保護作用,能夠顯著改善血漿TP以及ALB水平。在試驗中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,血漿中TP、ALB以及GLB水平都呈升高趨勢,說明鞣花酸在一定程度上參與機體蛋白質代謝,改善機體血漿中總TP、ALB以及GLB水平,維持機體健康[16]。BUN濃度的高低可直接反映機體蛋白質代謝和氨基酸的平衡狀況[17]。日糧中粗蛋白質含量充足,氨基酸種類和比例均衡時,機體蛋白質、氨基酸的利用率提高,BUN含量就會降低[18]。試驗中,灌喂石榴皮瓤提取物的小鼠血漿中BUN呈下降趨勢。石榴皮瓤提取物的灌喂能夠促進機體蛋白質的代謝,平衡氨基酸的水平[19-20]。

3.3氧化應激是機體內產生的自由基與抗氧化防御系統失衡的一種生物學現象[21]。MDA是脂質過氧化的產物,其含量可反映細胞氧化應激水平或器官脂質過氧化的程度[15]。Qiu等[22]通過測量膀胱癌T24細胞內的ROS水平、MDA水平和SOD活性來驗證鞣花酸和尿石素A的抗氧化活性,發現鞣花酸和尿石素A均可降低H2O2誘導的膀胱癌T24細胞中的ROS和MDA水平,并增加了SOD的活性,尿石素A與其前體鞣花酸均可緩解T24細胞的氧化應激。駱靜方等[23]研究發現,給糖尿病小鼠補喂鞣花酸后,其血漿中SOD活性升高、MDA含量顯著降低。陳敏純等[24]研究鞣花酸對缺血性腦卒中大鼠的保護作用結果顯示,給予小鼠鞣花酸藥物處理后,MAD含量顯著降低并且能夠顯著增加SOD的活性。試驗中,灌喂石榴皮瓤提取物極顯著提高了試驗組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活性,顯著提高了試驗組小鼠血漿中SOD活性、CAT以及T-AOC的水平,顯著降低了試驗組小鼠血漿MDA的濃度,鞣花酸可以增強小鼠清除自由基以及機體抗氧化的能力。鞣花酸的生物學作用主要依賴腸道微生物代謝產生的尿石素[25]。尿石素是由鞣花酸失去一個內酯環,并逐步脫羥基而生成的[26],其保留了一定的抗氧化能力。鞣花酸及其衍生物的抗氧化效率與酚羥基數目有關[27],鞣花酸打開一個內酯環脫去羧基生成尿石素D,尿石素D通過脫去1,2或3個羥基分別生成尿石素C,尿石素A或尿石素B[28]。在氧化自由基吸收能力(ORAC)抗氧化指數試驗中與抗壞血酸相比,尿石素A是尿石素類中抗氧化能力最強大的代謝產物[29]。線粒體自噬可通過調控線粒體的分裂與融合以清除功能受損的線粒體并抑制ROS的過量積累,對預防氧化損傷具有重要作用[30]。研究表明,短期的尿石素A處理可能會誘導線粒體自噬,維持線粒體呼吸功能,而長期尿石素A處理有助于促進線粒體生物合成[31]。試驗中小鼠清除自由基以及機體抗氧化能力的提升,一方面可能與鞣花酸及其代謝產生的尿石素具有降低MDA含量、降低ROS、RNS水平以及提高SOD、CAT、GSH活性有關,另一方面鞣花酸及其代謝產生的尿石素激活了參與自噬啟動的關鍵酶AMP激活的蛋白激酶 α(AMPK α)以及張力蛋白同源物誘導的蛋白激酶1(PINK-1)[32],誘導線粒體自噬,并清除功能受損的線粒體以及抑制ROS的過量積累,從而提高了小鼠的抗氧化能力。

3.4多酚類化合物抗炎的生物學作用在人和動物模型實驗中已被證實[7]。繆福俊等[32]研究發現,在核桃多酚中,在機體內通過抑制TNF-α以及IL-6等相關炎癥因子的表達,減輕炎癥反應。肖玉欣等[7]研究表明,鞣花酸抗炎活性主要表現為降低MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及降低細胞遷移與粘附。鞣花酸抗炎活性主要表現為降低機體相關炎癥因子的表達以及降低細胞遷移與黏附。Marin等[33]驗證了鞣花酸在急性和慢性潰瘍性結腸炎中的抗炎作用,鞣花酸能夠降低IL-6和TNF-α的分泌。鞣花酸的生物學作用的發揮主要依靠腸道微生物將其代謝為尿石素[7]。在動物模型中,尿石素對于小鼠足水腫具有急性抗炎作用[34],并且尿石素可減少小鼠全身性炎癥因子的產生(IL-6,TNF-α)[35]。IL-17是T細胞誘導的炎癥反應早期啟動因子,可以促進T細胞的激活和刺激細胞黏附分子,從而導致炎癥的產生[36]。試驗中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物能夠顯著降低試驗組小鼠血漿中TNF-α和IL-17A的水平,鞣花酸具有促進炎癥因子分泌,抑制炎癥因子表達的作用。可能與鞣花酸能夠降低調節炎癥反應關鍵分子的表達與含量有關,如TNF-α和IL-10,同時可能由于鞣花酸能夠減弱成纖維細胞和內皮細胞的遷移以及單核細胞的黏附[37],從而抑制炎癥反應,具體的調控路徑和潛在的機制有待于進一步的研究表明。

4 結 論

給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物可顯著提高小鼠末重、總增重及平均日增重,促進小鼠生長發育;可極顯著提高試驗組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活力;顯著提高SOD、CAT以及T-AOC水平;顯著降低MDA、TNF-α和IL-17A的水平。鞣花酸具有提高小鼠抗氧化以及緩解炎癥的作用。