刺梨果渣酵素復合發酵工藝優化

陳秋慧,魏建敏,穆先,盧紅梅,楊雙全,陳莉*

(1.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴陽 550025;2.貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴陽 550025;3.貴州大學 化學與化工學院,貴陽 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)又叫送春歸、茨梨,是薔薇科落葉灌木植物繅絲花的果實,適宜生長在海拔500～1 500 m的高山丘陵地帶,如中國西南地區的貴州、云南、四川等省份,其中貴州刺梨產量居全國之首[1-2]。截至2021年,作為刺梨種植大省的貴州省,其種植面積已達到210萬畝,鮮果產量達28.91萬噸。隨著國內外果蔬汁飲料逐漸向營養型方向轉變,刺梨因富含營養成為營養型飲料的研究熱點之一[3]。

刺梨果渣是刺梨鮮果壓榨刺梨原汁所留下的副產物,刺梨果渣含有豐富的營養物質[4],具有抗氧化、降血糖等功效[5-7],有很高的價值,但不易儲存,造成大量浪費且污染環境[8]。酵素因富含益生菌、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶和多酚、黃酮、氨基酸、有機酸等生物活性成分而在食品和健康領域受到廣泛關注[9-10]。大量研究表明,酵素具有抗氧化、抗腫瘤、解酒護肝、調節腸道菌群、減肥、抑菌等功效[11-16]。相關研究表明,酵素經發酵后不僅能大量保留發酵基質原有的營養物質,而且能促進多酚、黃酮等次級產物的形成,具有促進新陳代謝、抗氧化、抗疲勞等生理功能[17]。因此,本試驗以酶解后的刺梨果渣為發酵物料,采取先酵母菌發酵后植物乳桿菌發酵的方式,在單因素試驗的基礎上進行優化試驗,探究不同因素對刺梨果渣酵素中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及活菌數的影響,以期得到刺梨果渣酵素的最佳發酵工藝條件,為刺梨果渣的開發利用提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 原料

刺梨干果渣:貴州省盤州市某刺梨加工企業提供。

1.2 試劑

活性干酵母(BV818、CECA、SY、RW):安琪酵母股份有限公司;植物乳桿菌1.191:廣東省微生物菌種保藏中心;SOD試劑盒:南京建成生物工程研究所;果漿酶、氯化鈉、次甲基藍、氯化鉀、無水氯化鈣(均為分析純):成都金山化學試劑有限公司;碳酸氫鈉、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、MRS肉湯培養基、營養瓊脂、蔗糖:天津永大化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

FA2004N精密電子天平 上海菁海儀器有限公司;HH-B數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;ZD-2A 自動電位滴定儀 上海大普儀器有限公司:SPX-250B生化培養箱 上海瑯玕實驗設備有限公司;YXQ-LS-5DS11壓力蒸汽滅菌鍋、SN-CJ-IF無菌操作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;TG16-WS 臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;Smart生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 刺梨果渣酵素制備工藝

工藝流程圖見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

酵母菌的活化:取一定量的安琪酵母(以發酵物料的質量計),加入適量的蒸餾水,于37 ℃的恒溫水浴鍋中活化30 min后待用。

植物乳桿菌的活化:取一管于EP管中甘油保藏的植物乳桿菌37 ℃活化后,接入100 mL滅菌后的MRS肉湯培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后待用。

1.4.2 酵母菌發酵階段單因素試驗

采用單因素輪換法,分別考察酵母菌菌種(BV 818、CECA、SY、RW)、發酵時間(8,16,24,32,40 h)、發酵溫度(21,23,25,27,29 ℃)、糖添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、酵母菌接種量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對SOD活性和酵母菌活菌數的影響,確定各因素的最佳值。

1.4.3 酵母菌發酵階段響應面試驗

在單因素試驗的基礎上,以發酵時間、糖添加量、發酵溫度、酵母菌接種量4個因素為研究因素,以SOD活性和酵母菌活菌數為評價指標,根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,并采用Design Expert 8.0.6軟件進行數據分析,確定刺梨果渣酵素的最優發酵條件。酵母菌發酵階段響應面試驗因素水平表見表1。

表1 酵母菌發酵階段響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test in yeast fermentation stage

1.4.4 乳酸菌發酵階段單因素試驗

以SOD活性和乳酸菌活菌數為評價指標,在發酵溫度37 ℃、乳酸菌接種量2%、發酵時間24 h、乳酸菌接種量2%的條件下,固定其他因素條件,確定發酵時間(8,16,24,32,40 h)、乳酸菌接種量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、發酵溫度(35,36,37,38,39 ℃)等因素的最佳值。

1.4.5 乳酸菌發酵階段正交試驗

在單因素試驗的基礎上,以發酵時間、乳酸菌接種量、發酵溫度為因素,以SOD活性和乳酸菌活菌數為評價指標,設計L9(33)正交試驗,每組試驗平行測定3次,因素水平表見表2。

表2 乳酸菌發酵階段正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test in lactic acid bacteria fermentation stage

1.4.6 SOD的測定

取1.0 g發酵物料,加入4 mL pH 6.8的磷酸緩沖液于研缽中研磨1～2 min后,轉入離心管中,4 000 r/min離心10 min,取上清液參照SOD試劑盒進行測定。

1.4.7 酵母菌活菌數的測定

采用血球計數法進行測定[18]。

1.4.8 乳酸菌活菌數的測定

參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的平板計數法進行測定。

1.4.9 數據處理及分析

每組試驗進行3次平行。采用Design Expert 8.0.6進行響應面試驗設計,SPSS 19.0、Excel 2010進行數據分析,Origin 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵階段單因素試驗

2.1.1 酵母菌菌種及發酵時間的確定

酵母菌種類及發酵時間對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖2。

圖2 發酵時間對不同菌種發酵的SOD活性及酵母菌活菌數的影響Fig.2 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of yeast fermented with different strains注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同。

由圖2可知,不同酵母菌菌種對SOD活性的影響很小,從整體來看,SOD活性與酵母菌活菌數成正比,均隨時間的增加呈先升高后降低的趨勢,這可能是因為隨著時間的增加,可利用的碳源減少,不能正常給酵母菌提供營養物質,從而導致酵母菌活菌數減少。當以SOD活性作為評價指標時,菌種RW在發酵時間為24 h時達到最大值261.22 U/g,此時酵母菌活菌數為1.24×108CFU/g;當以酵母菌活菌數為評價指標時,菌種CECA在發酵時間為24 h時達到最大值1.30×108CFU/g,此時SOD活性為259.67 U/g。綜合考慮,選擇菌種CECA進行發酵,取發酵時間16～32 h進行后續研究。

首先，如今財務管理也進入了信息化時代，如果沒有專業過硬的財務相關知識，中小學的財務管理水平就不會與時俱進，所以在對財務人員進行入職選擇時，應考慮該財務人員是否持有相關的專業資格證書，是否具有財務工作經驗，以保證將來學校財務人員的專業性和實踐能力。

2.1.2 糖添加量的確定

糖添加量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖3。

圖3 糖添加量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響Fig.3 Effect of sugar addition amount on SOD activity and viable number of yeast

由圖3可知,隨著糖添加量的增加,SOD活性和酵母菌活菌數呈先上升后下降的趨勢,當糖添加量從3%上升到5%時,酵母菌活菌數隨著可利用碳源的增加而增加,SOD活性隨之增加,在糖添加量為5%時達到最大值,此時SOD活性為257.54 U/g,酵母菌活菌數為1.29×108CFU/g;當糖添加量從5%上升至7%時,發酵體系中糖量過高,形成高滲狀態,抑制菌種的生長和代謝,產酶活力下降,SOD活性和酵母菌活菌數逐漸降低[19];同時,糖添加量過高會使pH值增加,不利于第二步發酵中植物乳桿菌的生長,因此選擇4%～6%的糖添加量進行后續研究。

2.1.3 發酵溫度的確定

發酵溫度對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對SOD活性和酵母菌活菌數的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of yeast

由圖4可知,隨著發酵溫度的增加,SOD活性和酵母菌活菌數均呈先升高后降低的趨勢,在25 ℃時達到最大值,此時SOD活性為259.09 U/g,酵母菌活菌數為1.30×108CFU/g。溫度過高或過低都不利于酵素的發酵,溫度過低,酵母菌生長緩慢,發酵周期長;溫度過高,會對機體的酶及代謝活動產生不利影響,使活菌數的增長速度減緩,因此選擇23～27 ℃進行工藝優化。

2.1.4 酵母菌接種量的確定

酵母菌接種量對SOD活性和酵母菌活菌數的影響見圖5。

由圖5可知,SOD活性隨著酵母菌接種量的增加先升高,在0.2%時達到最大值260.08 U/mL,之后隨著酵母菌接種量的增加而降低,接種量在0.1%～0.2%范圍內酵母菌活菌數隨著接種量的增加而增加,在0.2%時達到最大值1.31×108CFU/g后趨于平穩,不再上升。初始接種量過低,菌種密度低,不能充分利用發酵體系中的碳源,使SOD活性不能達到最大值;若初始接種量過高,菌體密度過大,導致前期繁殖速度過快,產生的大量有機酸使SOD活性降低[19],綜合考慮,選擇0.15%～0.25%進行響應面優化。

2.2 酵母菌發酵階段響應面試驗

在單因素試驗的基礎上,選取發酵時間(A)、糖添加量(B)、發酵溫度(C)、酵母菌接種量(D)4個因素,以SOD活性、酵母菌活菌數為響應值,通過Design Expert 8.6.0軟件進行試驗設計,試驗設計及結果見表3。

以SOD活性、酵母菌活菌數為響應值,利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合,得到SOD活性(Y1)、酵母菌活菌數(Y2)的回歸方程分別為:

Y1=259.45-3.44A-0.27B-15.83C+1.00D-7.21AB-27.41AC-4.91AD-2.75BC-4.00BD+18.40CD-32.82A2-16.54B2-27.85C2-27.29D2;

Y2=1.42+0.015A-0.021B-0.023C+0.074D+0.073AB+(5.000E-004)AC+0.065AD+(7.125E-003)BC+0.053BD+(8.125E-003)CD-0.19A2-0.19B2-0.13C2-0.086D2。

SOD活性、酵母菌活菌數方差分析及顯著性結果見表4和表5。

表4 SOD活性方差分析及顯著性結果Table 4 SOD activity variance analysis and significance results

表5 酵母菌活菌數方差分析及顯著性結果Table 5 Variance analysis and significance results of viable number of yeast

由表4和表5可知,兩個回歸模型均極顯著(P<0.000 1),說明該模型能很好地描述試驗結果,得出的方程有意義。失擬項的P值分別為0.444 2,0.182 8,均大于0.05,差異不顯著,說明該模型擬合度較好。相關系數分別為0.980 4,0.979 5,調整相關系數分別為0.960 8,0.958 9,說明試驗誤差較小,具有較高的參考價值,可以對SOD活性和酵母菌活菌數進行預測分析。

當以SOD活性為響應值時,一次項C極顯著,A顯著,B、D不顯著;交互項AC、CD極顯著,AB顯著,AD、BC、BD不顯著;二次項A2、B2、C2、D2均極顯著。由F值可知,各因素對SOD活性的影響大小為C>A>D>B,即發酵溫度>發酵時間>酵母菌接種量>糖添加量。當以酵母菌活菌數為響應值時,一次項D極顯著,B、C顯著,A不顯著;交互項AB、AD、BD極顯著,AC、BC、CD不顯著,二次項A2、B2、C2、D2均極顯著。由F值可知,各因素對酵母菌活菌數的影響大小為D>C>B>A,即酵母菌接種量>發酵溫度>糖添加量>發酵時間。

各因素對響應值影響的響應面及等高線見圖6和圖7。

圖6 各因素交互作用對SOD活性的影響Fig.6 Effects of interaction of various factors on SOD activity

圖7 各因素交互作用對酵母菌活菌數的影響Fig.7 Effects of interaction of various factors on viable number of yeast

響應面圖曲面坡度越陡峭,其對應的等高線越密集,形狀呈橢圓形或馬鞍形,說明兩因素間交互作用影響越大[20]。由圖6可知,因素A與因素C、因素C與因素D間的曲面最陡峭,因素A與因素B間的陡峭程度次之,且等高線均呈橢圓形,說明兩兩因素間交互作用較強,影響顯著;因素A與因素D、因素B與因素C、因素B與因素D間響應面曲面較平緩,等高線近似圓形,表明各因素間交互作用較弱,影響不顯著。由圖7可知,因素A與因素B、因素A與因素D、因素B與因素D間所形成的坡面陡峭,等高線密集,呈橢圓形,說明兩兩因素間對酵母菌活菌數的影響較大,交互作用顯著;因素A與因素C、因素B與因素C、因素C與因素D間的響應面曲面較平緩,等高線較稀疏,交互作用影響不顯著。

2.3 響應面驗證試驗

利用軟件Design Expert 8.6.0對兩個模型聯合求解,得到酵母菌發酵階段最佳工藝條件為發酵時間24.3 h、糖添加量4.97%、發酵溫度24.67 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下SOD活性預測值為260.30 U/g,酵母菌活菌數預測值為1.43×108CFU/g。考慮到試驗操作問題,將最佳工藝條件修正為發酵時間24.5 h、糖添加量5%、發酵溫度24.7 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下進行3次平行驗證試驗,得到SOD活性為(267.64±3.43) U/g,酵母菌活菌數為(1.41±0.04)×108CFU/g,試驗值與預測值接近,表明該模型確定的工藝條件較可靠。

2.4 乳酸菌發酵階段單因素試驗

2.4.1 發酵時間的確定

發酵時間對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖8。

圖8 發酵時間對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.8 Effect of fermentation time on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖8可知,發酵時間少于24 h時,SOD活性隨著發酵時間的增加而上升,發酵時間為24 h時,SOD活性達到最大值271.99 U/g,此時乳酸菌活菌數為5.25×107CFU/g,繼續進行發酵,隨著發酵時間的延長,SOD活性逐漸降低;乳酸菌活菌數在發酵初始階段迅速上升,在16 h時達到最大值5.79×107CFU/g,此時SOD活性為269.84 U/g,當發酵時間超過16 h時,乳酸菌活菌數出現下降趨勢,說明此時接近植物乳桿菌生長繁殖的活躍期。綜合考慮,選擇發酵時間8～24 h進行優化。

2.4.2 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌接種量對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖9。

圖9 乳酸菌接種量對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.9 Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖9可知,當乳酸菌接種量較低時,SOD活性及乳酸菌活菌數都較低,當乳酸菌接種量為2%時,SOD活性達到最大值270.47 U/g,此時繼續增大接種量,乳酸菌活菌數先小幅度上升后開始出現下降趨勢,而SOD活性急劇下降,這是因為當乳酸菌初始菌種密度過大時,其生長代謝速度過快,發酵過度,產生的總酸含量過高,影響了SOD的活性[21]。因此,選擇接種量1.5%～2.5%進行優化。

2.4.3 發酵溫度的確定

發酵溫度對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響見圖10。

圖10 發酵溫度對SOD活性和乳酸菌活菌數的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on SOD activity and viable number of lactic acid bacteria

由圖10可知,隨著發酵溫度的增加,SOD活性和乳酸菌活菌數先略微上升,SOD活性在37 ℃時達到最大值270.83 U/g,此時乳酸菌活菌數為5.05×107CFU/g;乳酸菌活菌數在36 ℃時達到最大值5.55×107CFU/g,此時SOD活性為270.18 U/g,當溫度超過37 ℃時,兩個指標均隨著溫度的增加呈下降的趨勢。因此,選擇發酵時溫度35～37 ℃進行后續優化。

2.4.4 乳酸菌發酵階段正交試驗

乳酸菌發酵階段正交試驗結果及分析見表6。

表6 乳酸菌發酵階段正交試驗結果及分析Table 6 Orthogonal test results and analysis of lactic acid bacteria fermentation stage

由表6可知,3個因素對SOD活性影響的主次順序為A>C>B,即發酵時間>發酵溫度>乳酸菌接種量,最優組合為A3C3B2,即發酵時間為24 h,發酵溫度為37 ℃,乳酸菌接種量為2%,在此條件下進行發酵,測得SOD活性為(264.98±2.23) U/g,乳酸菌活菌數為(1.48±0.17)×108CFU/g;3個因素對乳酸菌活菌數影響的主次順序為A>B>C,即發酵時間>乳酸菌接種量>發酵溫度,最優組合為A2B2C1,即發酵時間為16 h,乳酸菌接種量為2%,發酵溫度為35 ℃,在此條件下進行發酵,測得SOD活性為(275.24±1.12) U/g,乳酸菌活菌數為(1.97±0.17)×108CFU/g,優于組合A3C3B2。因此,以發酵時間16 h、乳酸菌接種量2%、發酵溫度35 ℃為最適發酵條件。

3 結論

在酵母菌與乳酸菌復合發酵的條件下發酵刺梨果渣,經響應面分析得出酵母菌發酵階段的最優條件為發酵時間24.5 h、糖添加量5%、發酵溫度24.7 ℃、酵母菌接種量0.21%,在此條件下刺梨果渣酵素發酵物料的SOD活性為267.64 U/g,酵母菌活菌數為1.41×108CFU/g;在正交試驗優化乳酸菌發酵階段,通過分析得到最佳條件為發酵時間16 h、乳酸菌接種量2%、發酵溫度35 ℃,在此條件下刺梨果渣酵素發酵物料的SOD活性為275.24 U/g,乳酸菌活菌數為1.97×108CFU/g。

刺梨果渣酵素經優化后,其活菌數顯著增加,這與郭玉如[22]的研究結果相似,說明酵母菌和乳酸菌對刺梨果渣發酵具有積極影響;其SOD活性較大,多發酵產品高[23-24],說明刺梨果渣在發酵過程中能很好地保留其原有和發酵所產生的營養基質,這與王霞等[17]的研究結果一致,因此,后期可進一步對該產品進行功能性研究,以探究其生理功能。