啟膈散增加食管癌對順鉑的敏感性與LncRNA MEG3的關系研究*

王靜,王美樂,尹素改,馮書營,陳玉龍,江華,李亞蘭,李姝璇

河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046

食管癌(esophageal cancer,EC)具有極強的地域性,在2020年惡性腫瘤中發病率排名第七位,總體死亡率排名第六位,中國屬于高發病率、高死亡率的國家之一[1-3]。食管癌常見的病理類型主要有鱗癌和腺癌,我國95%以上為鱗癌[4]。食管癌的發病年齡多在40歲以上,多數表現為間斷性或進行性吞咽梗阻等特異性癥狀[5-6]。手術和化療是常用的治療手段,但化療的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)已經成為腫瘤切除、轉移和復發的關鍵挑戰[7]。

食管癌屬于中醫“噎膈”范疇,病機包括氣郁、痰阻、血瘀、氣血津虧。其中,痰氣交阻是其發生的主要病機,痰氣交阻證是其最常見證候之一。朱丹溪言:“痰之為物,在人身隨氣機升降,無處不到”,氣機不暢,氣郁生痰,痰氣互阻,久而致瘀是食管癌發病的途徑[8]。啟膈散具有潤燥解郁、化痰降逆之功效,出自清代程國彭的《醫學心悟》,“通噎膈,開關之劑,屢效”[9]。啟膈散是目前常用于治療食管癌的經典方劑,在臨床治療中取得了良好效果。研究發現,啟膈散可誘導食管癌細胞凋亡并可增加食管癌細胞對順鉑的敏感性,但具體機制仍需深入研究[10-11]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA)是目前腫瘤耐藥性機制研究的熱點。母系表達基因3 (maternally expressed gene 3,MEG3)是第一個被發現具有腫瘤抑制作用的LncRNA。另外,在鼻咽癌的研究中,MEG3充當腫瘤抑制因子,增加人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)表達來促進鼻咽癌細胞的自噬和凋亡[12]。但在食管癌中,MEG3的表達是否參與食管癌的發生、發展、預后與轉歸及啟膈散是否通過MEG3干預食管癌細胞增殖并增加食管癌細胞對順鉑的敏感性,目前尚不清楚。

因此,本研究從啟膈散對食管癌EC9706細胞增殖和凋亡的影響為切入點,研究啟膈散增加順鉑敏感性與LncRNA MEG3的關系及其機制,為開發治療食管癌的中藥提供理論和實驗依據,為尋找抗腫瘤藥物的作用靶點提供支撐。

1 材料

1.1 細胞人食管癌EC9706細胞株由河南中醫藥大學分子生物實驗中心饋贈。

1.2 藥物與試劑順鉑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、5×蛋白上樣緩沖液、彩虹245廣譜蛋白Marker、ECL Plus超敏化學發光液(北京索萊寶科技有限公司,批號:D8810、CA1020、PC0020、R0010、P0100、P1040、PR1920、PE0010);TRIzol試劑(美國ambion公司,批號:15596);TB Green Premix Ex Taq、Primescript RT Master Mix(日本TaKaRa公司,貨號:RR420A、RR036A);SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:G2037-50T);PTEN抗體、GAPDH抗體、HRP 標記山羊抗兔二抗(美國proteintech公司,批號:22034-1-AP,10494-1-AP,SA00001-2)。

1.3 儀器超凈工作臺(北京世安科林凈化技術有限公司,型號:SIX-70);二氧化碳培養箱、PCR儀(美國賽默飛公司,型號:371、Quanti Studio 7 Flex);倒置顯微鏡(日本Olympus公司,型號:CKX41);酶標儀(美國BIO-TEK公司,型號:Cytation 5);流式細胞儀(美國BD Accuri公司,型號:Accuri C6 Plus);蛋白通用電泳儀(美國BIO-RAD公司,型號:Power Pac Universal 1645070)。

2 方法

2.1 藥物制備啟膈散藥物劑量比例為沙參丹參茯苓川貝母(去心)郁金砂仁殼杵頭糠=6623111,采取乙酸乙酯法提取,濃縮干燥,冷藏備用。

2.2 MTT法檢測細胞活性取對數生長期的EC9706細胞,以1×104個/孔接種于96孔板中,置于細胞培養箱中培養24 h,吸走舊培養液,加入不同劑量的啟膈散及相應濃度的啟膈散聯合2 mg·L-1順鉑,每組設5個復孔。加藥48 h后吸出舊液,按 91 比例用RPMI 1640培養基稀釋MTT儲存液,MTT終濃度為0.5 g·L-1,繼續培養4 h,加入 DMSO 150 μL,酶標儀570 nm下檢測吸光度(absorbance,A)值,計算各組抑制率E值,并用金氏Q值公式法評價聯合用藥是否具有協同作用,選取適當濃度進行后續實驗。

E=(1-A藥物組/A對照組)×100%

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

Q>1.15表示聯合用藥具有協同作用,Q為0.85～1.15表示聯合用藥具有相加作用,Q<0.85表示聯合用藥具有拮抗作用(Ea+b:啟膈散與順鉑聯合用藥組的抑制率;Ea:啟膈散組的抑制率;Eb:順鉑組的抑制率)。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率取對數生長期的EC9706細胞,以3×105個/孔接種于6孔板中,培養24 h,加藥培養48 h,收集培養液,加入不含EDTA的胰酶消化并收集細胞,用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次,加入緩沖液500 μL重懸細胞,每管加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL,室溫避光孵育5 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.3 蛋白免疫印跡實驗提取細胞總蛋白,在冰上裂解提取各組總蛋白。BCA法測定樣本蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液按比例混合樣品,100 ℃加熱10 min變性,進行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,轉膜,采用Tris堿緩沖液配置的5%牛奶封閉2 h,添加一抗PTEN(稀釋比例12 000)、GAPDH(稀釋比例12 500),4 ℃冰箱孵育過夜,次日用TBST洗膜3次,每次10 min。添加二抗(稀釋比例15 000)孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min;加入ECL超敏發光液,凝膠成像儀中曝光各組蛋白條帶,用Image J統計條帶灰度值。

2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR,RT-PCR)加藥48 h后,TRIzol法提取各組細胞樣品總RNA,按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA,逆轉錄條件為37 ℃反應15 min,85 ℃ 反應5 s。配制反轉錄體系總體積20 μL進行擴增反應,PCR反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火45 s,共40個循環。結果以GAPDH為內參,引物序列見表1,利用2-ΔΔCt公式計算各個樣品中目的基因相對表達量。

表1 基因引物序列

2.5 細胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞遷移劃痕實驗:細胞常規培養,將對數生長期EC9706細胞接種在6孔細胞培養板,置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中,待細胞融合度達到90%左右,用 200 μL 的槍頭沿直尺畫水平線的垂直線,加入PBS緩沖液去除劃掉的細胞,輕輕清洗3次,以免沖散單層貼壁細胞。按上述實驗分組加藥處理細胞,均使用無血清培養基培養,從換為含對應藥物的無血清培養基起開始計算,分別于0 h、48 h拍照觀察,每次拍照觀察前,應再次清洗細胞,去除凋亡的細胞。以Image J軟件統計分析劃痕面積,計算細胞遷移率。Transwell實驗:實驗前將細胞饑餓培養24 h,在各組Transwell小室的上室中加入濃度為2×105mL-1細胞懸液0.3 mL,下室加入0.7 mL含10% FBS的完全培養基或含對應藥物的完全培養基,培養48 h后甲醛固定,結晶紫染色后PBS洗滌,晾干,顯微鏡下計遷移細胞數。

細胞遷移率=(初始空白面積-某時間點空白面積)/初始空白面積×100%

3 結果

3.1 藥物對食管癌EC9706細胞增殖的影響與對照組比較,當啟隔散濃度為12.5 mg·L-1時,可促進EC9706細胞的增殖,但差異不具有統計學意義(P>0.05);啟膈散濃度≥50 mg·L-1可顯著抑制EC9706細胞的增殖,隨著劑量的增大,抑制率逐漸上升(P<0.01),見圖1。選取0 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1濃度的啟膈散聯合2 mg·L-1順鉑作用EC9706細胞48 h后,細胞活力顯著降低(P<0.01);與順鉑組比較,50 mg·L-1、100 mg·L-1的啟膈散聯合順鉑可顯著降低細胞的增殖能力,Q值分別為1.15、1.03,具有藥物相加作用(P<0.01),見圖2。根據實驗結果,選取50 mg·L-1的啟膈散、2 mg·L-1順鉑、50 mg·L-1的啟膈散聯合2 mg·L-1順鉑用于后續實驗。

注:與對照組比較,* P<0.05;**P<0.01;與順鉑組比較,# P<0.05,# #P<0.01;圖中負值表示促進增殖。

3.2 啟膈散和順鉑聯合作用誘導EC9706細胞凋亡與對照組比較,啟膈散組、啟膈散聯合順鉑組鏡下可看到細胞固縮變圓,凋亡率明顯增加(P<0.01);與順鉑組比較,啟膈散組和啟膈散聯合順鉑組的早期凋亡率顯著增加,總凋亡率顯著增加,具有統計學差異(P<0.01),見圖3、圖4,表2。

3.3 啟膈散和順鉑聯合作用可增加食管癌EC9706細胞中PTEN蛋白表達的影響與對照組比較,啟膈散組、順鉑組、啟膈散聯合順鉑組PTEN蛋白表達量均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與順鉑組比較,啟膈散組、啟膈散聯合順鉑組PTEN蛋白表達量均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

注:CON:對照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯合順鉑組;與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.4 啟膈散聯合順鉑對食管癌EC9706細胞MEG3mRNA、PTENmRNA表達的影響結果顯示,與對照組比較,啟膈散組、啟膈散聯合順鉑組的MEG3mRNA、PTENmRNA表達量顯著升高(P<0.01),順鉑組MEG3mRNA表達量增加,但無統計學差異(P>0.05),PTENmRNA表達量增加,具有統計學差異(P<0.05)。與順鉑組比較,啟膈散聯合順鉑組MEG3mRNA表達量極顯著升高(P<0.01),PTENmRNA表達量顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注:CON:對照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯合順鉑組;與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.5 啟膈散聯合順鉑對食管癌EC9706細胞遷移的影響藥物作用48 h后,對照組的遷移率增高,劃痕面積減少,其余各組劃痕面積增大,出現反向遷移現象。與對照組比較,啟膈散組、順鉑組和啟膈散聯合順鉑組細胞遷移率降低(P<0.01);與順鉑組比較,啟膈散聯合順鉑組遷移率顯著降低(P<0.01)。由Transwell遷移實驗可知,與對照組比較,啟膈散組和啟膈散聯合順鉑組遷移細胞減少。見圖7。

注:CON:對照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯合順鉑組;與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。A:細胞劃痕實驗結果(10×),B:Transwell實驗結果(20×),C:細胞劃痕統計結果(其中負值表示抑制遷移)。

4 討論

食管癌是常見的惡性腫瘤之一,手術和化療是常用的治療方法,可以取得一定的臨床療效,但其5年生存率僅為15%～20%,MDR是治療食管癌的主要障礙之一[13]。《諸病源候論》有五噎和五膈記載,氣機郁結不暢,氣病失運,津凝而為痰,血滯而為瘀,繼而痰瘀乃生。食管癌的發病以正氣虧虛為主,與痰、瘀、熱關系密切,正虛邪實是食管癌的主要病機,臨床診療中以扶正攻毒為主要治療原則,司富春研究團隊收集研究151篇食管癌相關文章發現:補虛、清熱、化痰散結、活血祛瘀類藥的使用占65%,主要治療方劑為啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯、補氣運脾湯[14]。臨床常用方劑啟膈散方中沙參養陰潤肺,益胃生津;貝母滋陰化痰,砂仁殼性溫味辛,行氣溫中;荷葉蒂平苦和胃,茯苓甘淡滲利健脾為佐,共同促進脾胃運化功能,顧護中焦,使生痰無源;郁金、丹參共行活血祛瘀之效;杵頭糠作為引藥,可通咽達胃、益氣養血健脾,有利于改善病情,提高機體免疫力,減輕吞咽梗塞、疼痛、嘔吐等癥狀,增強消化道功能。大量臨床研究資料表明,啟膈散在有效抑制食管癌細胞生長及擴散、降低復發轉移率的同時,可明顯減輕化療的毒副反應,改善血清中癌胚抗原、鱗狀上皮癌相關抗原、卡氏評分,提高患者生活質量,使部分患者處于荷瘤生存狀態,提升整體療效[15-17]。課題組前期研究發現,啟膈散可干預食管癌細胞的增殖,因而本文以啟膈散為研究對象,探索其內在機制。

LncRNA MEG3是位于人類染色體14q32.3上的印記基因,約1 600個核苷酸片段,是具有腫瘤抑制作用的LncRNA[18-19]。它在許多正常組織高表達,但在一些原發性惡性腫瘤組織如食管癌、胃癌、口腔鱗癌等中低表達甚至不表達,與腫瘤患者的不良預后存在相關性[20-22]。過表達MEG3可增加內質網應激相關蛋白的表達,同時能夠抑制細胞生長,誘導EC109細胞凋亡,是ESCC中一種新的診斷和預后生物標志物及治療靶點,但機制尚不明確[23]。本研究MTT實驗、劃痕實驗及Transwell實驗結果顯示,啟膈散可有效抑制食管癌EC9706細胞的增殖、促進細胞凋亡、改變細胞形態、降低細胞貼壁率、抑制細胞的遷移,且聯合順鉑使用達到藥物相加作用。qRT-PCR的結果顯示,啟膈散組及啟膈散與順鉑聯合用藥組可上調LncRNA MEG3的mRNA水平,這表明啟膈散可能是通過干預LncRNA MEG3的表達來抑制食管癌細胞的增殖并增加細胞對順鉑的敏感性的,且LncRNA MEG3可能是食管癌防治的重要靶點。

PTEN基因位于10q23.3上,是人第10號染色體的基因,屬于抑癌基因,可以抑制腫瘤的生長和轉移,并在調節細胞周期和維持基因組穩定性方面發揮作用[24-25]。當腫瘤微環境中的PTEN低表達時,會影響腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM)中不同免疫細胞群的數量,誘導M2 TAM的極化并促進腫瘤轉移[26]。另有研究表明,MEG3參與調節PTEN水平,在宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌的發生發展中發揮重要作用[27-29]。本研究中PTEN的結果顯示,啟膈散組及啟膈散聯合順鉑組PTEN蛋白及其mRNA水平均呈上升趨勢,可初步推斷啟膈散可能是通過干預LncRNA MEG3的表達進而上調PTEN,起到抑制食管癌細胞增殖并增加食管癌細胞對順鉑敏感性的作用。

綜上所述,啟膈散干預EC9706細胞的增殖和遷移,促進凋亡,增加食管癌細胞對順鉑的敏感性,其機制可能與其上調 MEG3進而影響PTEN信號通路有關。課題組下一步準備對LncRNA MEG3進行敲除,觀察啟膈散是否還具治療并增加化療藥物順鉑敏感性的作用,進一步探究啟膈散的作用機制。