土壤和沉積物中22 種苯胺類化合物的測定
——液相色譜法

鐘福生，廖福然，舒金科

（重慶新天地環境檢測技術有限公司，重慶 401122）

苯胺類化合物是具有高毒性的化工原料和中間產品，能通過多種形式進入人體，包括接觸、吸入等，會對人體神經和心血管系統造成不可修復的傷害。由于苯胺類化合物溶于水，很容易在工業廢水中殘留并排放進土壤環境中[1]。土壤中的微生物很難降解苯胺類化合物，經年累月，該化合物在土壤中富集，破壞土壤結構，給環境帶來不可逆轉的污染傷害。因此學界一直在探索完善苯胺類化合物的測定方法。

目前，苯胺類化合物的各種測定方法研究介質截然不同，針對土壤和沉積物中苯胺類的測定方法仍然相對稀缺[2]。最新的液相色譜-三重四極桿質譜法（HJ1210-2021）標準只能測15 種苯胺類化合物，且所用儀器價格昂貴，檢測成本高，遠遠不能滿足實際檢測需求[3]。因此,需要探索更加便捷有效的多種苯胺類測定液相色譜法。本研究旨在拓展土壤和沉積物中苯胺類化合物定性、定量檢測類型的數量范圍[4]。通過優化提取和凈化的方法，提高樣品前處理質量。通過改善液相色譜法分離條件，進行質量控制與保證技術研究來確定22 種苯胺類化合物檢測分析方法的相關參數并進行方法驗證。

1 實驗過程

1.1 準備儀器與試劑

本研究所用主要儀器有KQ-500DV 型超聲波清洗器（昆山）、H/T16MM 型離心機（湖南赫西）、EF-AADL24-RF 氮吹儀（上海安普）、1260 Ⅱ液相色譜儀（安捷倫）。

主要試劑有二氯甲烷、正己烷、丙酮、甲醇、甲酸、氨水、三氯乙酸、五水合硫代硫酸鈉等。除了五水合硫代硫酸鈉為分析純，其余試劑均為色譜純。

1.2 色譜條件

本研究選用優化后的色譜柱：AgiLent ZORBAX SBC18（4.6mm×50mm×1.8μm）。該色譜柱適用于高水溶性的弱堿性物質，分析結果顯示圖譜峰形對稱，響應迅速且強烈，說明能較好地分離化合物。

流動相的pH 值是影響化合物保留時間的重要因素之一，因此選擇的流動相在整個梯度洗脫過程中pH 值要恒定[5]。相比于乙腈，甲醇和0.01%甲酸溶液的響應值更強。最終的流動相為：甲醇純試劑溶液,甲酸水溶液1+10000。

適當的流速控制是影響圖譜分析的關鍵因素。流速太快時，離子化效率會降低；如果流速太慢，則分析時間長，容易出現拖尾問題。經過多次測試，將最佳流速限定在0.5 至1.2mL/min 之間。反復比較后確定當流速為1.0mL/min時，4-甲基苯胺、3-甲基苯胺和2-甲基苯胺能有效分離。此時最適宜的柱溫為35℃，紫外波長為234nm。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

表2 土壤和沉積物加標0.125mg/kg 的準確度與回收率

1.3 樣品前處理

本實驗所用土壤、水體和海洋沉積物樣品的采集分別按照HJ/T 166、HJ494 和GB 17378.3 的相關要求進行。將樣品脫水凍干研磨至0.25mm 的顆粒，放置在清洗潔凈的聚四氟乙烯棕色玻璃瓶中冷凍保存，并將溫度控制在-18℃。

樣品提取：稱取2g 凍干樣品至離心管中，加入1g五水合硫代硫酸鈉，依次加入10.00mL 正己烷-丙酮混合溶劑和100μL 氨水，密封旋渦混勻。25℃以下冰浴超聲提取30min，6000r/min 離心10min，取上清液經0.22μm 針式濾器過濾。

樣品凈化：分別用5mL 二氯甲烷和5mL 甲醇沖洗、平衡C18 固相萃取小柱。溶劑填滿小柱后可關閉流速控制閥，使小柱得到充分浸潤。5min 后緩慢打開控制閥。在此期間將2.00mL 過濾后的樣品提取液轉入柱內，保證移取工作在溶劑流干前完成。廢棄多余的流出液后關閉控制閥。最后加入5mL 甲醇。等待5min 后打開控制閥收集洗脫液。

樣品濃縮：將凈化后的洗脫液氮吹濃縮至不少于0.8mL,用甲醇定容至1mL。

樣品制備：將750μL 新鮮去離子水加入250μL 濃縮后的凈化洗脫液中，并使兩者混合均勻。再用0.22μm針式濾器過濾。

2 實驗結果

2.1 標準曲線

由低到高依次配制至少5 個濃度點的標準系列，甲醇比例為25%。該方法在0.05～5mg/L 范圍內正相關線性擬合趨勢較好，擬合優度R 值均大于99.9%。

2.2 標準色譜出峰順序

出峰順序：（1）苯胺；（2）對硝基苯胺；（3）聯苯胺；（4）3-硝基苯胺；（5）2-甲氧基苯胺；（6）2-甲基苯胺；（7）3-甲基苯胺；（8）對甲基苯胺；（9）對氯苯胺；（10）4-溴苯胺；（11）2,6-二甲基苯胺；（12）2,6-二甲基苯胺；（13）2-萘胺；（14）2.4-二甲基苯胺；（15）6-氯-2,4-二硝基苯胺；（16）2-溴-6-氯-4-硝基苯胺；（17）鄰硝基對氯苯胺；（18）3,3-二氯聯苯胺；（19）2-溴-4,6-二硝基苯胺；（20）2，6-二溴-4-硝基苯胺；（21）N-亞硝基二苯胺；（22）2，4，6-三氯苯胺。

2.3 檢出限與測定下限

采用外標定量模式，分別計算實驗室內檢出限與測定下限。選擇空白石英砂樣品進行加標實驗。目標化合物和不同土質會產生差異化的基質效應，因此要采用不同等級的異質性加標濃度。空白石英砂的加標濃度為0.125mg/kg、0.75mg/kg、1.25mg/kg，進行7次平行測定。稱取空白石英砂2g 共7 份至離心管中，加入適量的濃度為5.0mg/L 苯胺類混合標準使用液。其余按照樣品預處理的步驟進行平行測定。依據公式MDL=t(n-1099)×S 可知，當置信度為99%，平行測定7個樣品時，t(6099)=3.143。測定下限為4 倍檢出限。

得到的檢出限中，13 種化合物的測定均值在3～5倍計算出的方法檢出限的范圍內，其余9 種化合物的測定均值在1～10 倍計算出的方法檢出限的范圍內。本實驗室的方法檢出限的確定方法與結果滿足HJ168-2020 技術準則的要求。

2.4 精密度

相關精密度與準確度測試數據結果表示，采用空白加標的方式，各添加濃度樣品的相對標準偏差范圍控制在3.9%至18.9%，具有良好的精密度與準確度。平均加標回收率在68.8%至117%之間波動，回收效果良好。

2.5 實際樣本準確度與加標回收率

選擇土壤和沉積物實際樣品進行加標實驗。以0.125 mg/kg 的加標濃度進行7 次平行測定。結果顯示，土壤和沉積物樣品的平均加標回收率在72.0%～104%之間，相對標準偏差在5.3%～16.3%之間，具有良好的準確度與回收率。

3 結論

本研究成功建立了一種能同時測定土壤和沉積物中22 種苯胺類化合物的液相色譜方法，創新點有兩方面。第一，成功利用超聲萃取方法高效分離了22 種苯胺類化合物，在前處理抗干擾關鍵環節取得突破。采用正己烷：丙酮（1:1）萃取溶劑，C18 固相萃取小柱凈化，用甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮定容。第二，成功完成22 種苯胺類化合物的方法驗證。利用高效液相色譜色譜儀分離測定，外標法定量，檢出限范圍在0.02～0.06mg/kg，平均加標回收率在68.8%～117%之間，相對標準偏差在3.9%～18.9%之間，結果的準確與精密性均達到了各項技術標準要求。本研究成果具有一定推廣普及意義，利于土壤和沉積物中苯胺類化合物監測的全面實施。