miR-381-3p在宮頸癌中靶基因及信號通路的分析*

魏林珍 馬曉梅 張 郎 陳 凡 秦天生

1 甘肅省人民醫院婦產科,甘肅省蘭州市 730000; 2 蘭州大學基礎醫學院; 3 甘肅中醫藥大學

宮頸癌是女性癌癥死亡第二大原因,宮頸癌的復發和轉移仍舊是診治的難題[1],開發敏感的診斷方法并找到新的治療策略是研究的熱點。miRNA是小單鏈非編碼RNA,它的過表達或下調可引起抑制基因或癌基因的激活,從而參與分化、增殖和存活等生物學過程。本研究利用TCGA數據庫研究宮頸癌組織中miR-381-3p的表達水平,并探索其可能的靶基因及分子調控機制,為宮頸癌的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 miR-381-3p基本資料 通過PubMed數據庫查詢miR-381-3p相關的文獻,并用miRBase和UCSC等查找miR-381-3p 的物種保守性、染色體定位等基本資料。見表1。

表1 在線數據庫名稱及網址

1.2 miR-381-3p在宮頸癌中的表達 通過TCGA網站獲取人腫瘤組織與腫瘤旁正常組織的miR-381-3p表達水平。利用UALCAN數據庫比較 miR-381-3p在宮頸癌中的差異表達水平。

1.3 miR-381-3p靶基因預測 使用miRWalk數據庫進行預測。為了提高準確性,設定預測結點為3’UTR,預測評分0.95,且同時能在TargetScan和miRDB數據庫被預測。

1.4 miR-381-3p靶基因的生物信息學分析 利用DAVID對miR-381-3p的靶基因實行GO功能注釋,設定條件是基因數目>10且得滿足P<0.05。對靶基因探究KEGG通路,設定條件是P<0.05。

1.5 蛋白與蛋白相互作用(PPI) 利用STRING數據庫構建 PPI網絡,利用 Cytohubba插件依EPC篩選前10位關鍵基因。

1.6 分析關鍵基因 利用GEPIA分析關鍵基因在子宮頸癌組織中和正常組織的表達,以P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 miR-381-3p基本信息 通過檢索得到 hsa-miR-210-3p定位在14q32.31染色體區域中,且在人、大鼠、獼猴、小鼠等多種物種之間維系高度保守性。見表2。

表2 miR-381-3p在不同物種中的基本信息

2.2 miR-381-3p在人各腫瘤組織和其在相應正常組織的表達差異 通過數據庫分析:miR-381-3p在多種腫瘤及其鄰近正常組織中都存在著差異表達。在腎上腺皮質癌、結腸癌、睪丸癌、子宮肉瘤等腫瘤中miR-381-3p呈顯著高表達,可能在這些腫瘤里充當癌基因角色。而在宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、多形性膠質細胞瘤等腫瘤中的表達顯著降低,miR-381-3p在這些腫瘤中可能發揮抑癌基因角色。見圖1。

圖1 miR-381-3p在不同的腫瘤組織中和腫瘤旁正常組織之間的表達

依據UALCAN平臺數據分析,miR-381-3p在宮頸癌患者組織中呈現顯著的低表達(見圖2a)。依據宮頸癌分期的資料與數據,與宮頸正常組織比較,S2、S3與S4的miR-381-3p表達水平均顯著性降低,且從其表達量數據分析發現,與宮頸癌分期呈負相關關系,但只有S1與S3之間有統計學差異(見圖2b)。依據宮頸癌分級的相應資料展現,與宮頸正常組織比較,G2和G3級的宮頸癌組織的hsa-miR-381-3p表達量均顯著降低,但宮頸癌分級之間并未見數據上的統計學差異(見圖2c)。 依據宮頸癌分期的相應資料顯示,正常宮頸組與宮頸癌淋巴結有無轉移組無統計學差異,宮頸癌組中有無淋巴結轉移間也未見統計學差異(見圖2d)。

a b c d

2.3 篩選miR-381-3p下游靶基因預測 通用miRWalk數據庫對miR-381-3p行靶基因預測,剔除重復,預測得到1 606個基因。進一步篩查,能被 miRTarBase和miRDB同時預測到,最終得到84個靶基因。

2.4 miR-381-3p靶基因GO與KEGG信號通路富集分析 對篩選出的84個靶基因實行GO注釋顯示:miR-381-3p的靶基因富集在對RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄進行正向調節和信號轉導的生物學過程,富集在細胞核、細胞質、胞漿、核質體、細胞膜、核體等細胞組分,富集在蛋白質結合和RNA聚合酶Ⅱ的轉錄因子活性序列特異性DNA結合等分子功能,結果見圖3。KEGG表明,靶基因富集于癌癥通路、乳腺癌、胃癌、Hippo、MAPK、肌動蛋白細胞骨架的調節等信號通路,見圖4。

圖3 miR-381-3p預測靶基因生物學過程、細胞組成、分子功能

圖4 miR-381-3p靶基因 KEGG信號通路富集分析

2.5 靶基因 PPI網絡構建及關鍵基因 基于STRING數據庫建靶基因蛋白與蛋白的網絡圖(見圖5),并根據EPC在CytoHubba插件篩選出網絡圖中前 10的關鍵基因,分別是 ESR1、LEF1、PBX1、CCND2、FGFR2、CADM1、TCF3、MPP6、PVRL1、UBE3A(見圖6)。

圖5 miR-381-3p靶基因蛋白與蛋白網絡圖

圖6 網絡圖中前 10的關鍵基因

2.6 驗證核心基因 利用 GEPIA在線分析網站,比較核心基因在宮頸癌和正常對照中的表達,結果顯示:與正常組織相比,宮頸癌組織中ESR1、PBX1、CCND2在表達水平較低(P<0.05)。見圖7。

圖7 宮頸癌組織(T)與正常宮頸組織(N)中ESR1、PBX1、 CCND2的表達

3 討論

宮頸癌不僅影響女性的生殖健康,而且對心理健康也造成一定的影響。因此,研究宮頸癌早期的診治標記物顯得尤為重要。現有研究發現,miRNA與宮頸癌有著一定的關系,可作為宮頸癌早期診治的標記物,也可以作為生物治療的靶點[2]。

前期研究發現,miR-381-3p與多種腫瘤關系密切,且在不同腫瘤中表現為抑癌基因或癌基因[3]。本研究通過TCGA數據庫發現miR-381-3p在宮頸癌組織中表達降低,這與Shang等[4]的研究相符。同時,根據UALCAN在線分析,miR-381-3p在宮頸癌患者的組織中出現顯著低表達,且與腫瘤分期、分級間有一定的關系,與有無淋巴結轉移無統計學差異。上述結果表明miR-381-3p在宮頸癌疾病中可作為抑癌基因,可能與宮頸癌發生有一定聯系。

為進一步探討miR-381-3p表達異常與宮頸癌的相互關系,需要預測靶基因及靶基因的功能。本研究利用miRWalk獲取 miR-381-3p的靶基因,為了增加準確性,且靶基因能在miRDB和miRTarBase中被預測到,共獲得84個miR-381-3p的靶基因。GO注釋表明,靶基因主要富集于信號轉導和RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的負向調節等生物學過程,富集在細胞核、細胞質等細胞組分,富集在蛋白質結合等分子功能。

KEGG結果表明,癌癥通路、乳腺癌、胃癌、Hippo、MAPK、肌動蛋白細胞的骨架調節等關鍵信號通路被富集。已有研究表明[5]MAPK途徑是從細胞外信號轉換為細胞內反應的重要橋梁。由于遺傳和表觀遺傳學的變化,在包括癌癥內的各種疾病中發現了信號級聯的改變。MAPK對癌癥治療的反應具有影響,特別是對實驗性MAPK抑制的反應中的補償途徑的激活。Hippo信號通路受到廣泛的細胞內和細胞外信號的調控,在許多癌癥類型中都觀察到了Hippo信號的失調, Hippo途徑的核心成分可能通過誘導腫瘤干細胞和增殖而啟動腫瘤發生,最終導致轉移和耐藥性,廣泛發生于宮頸癌[6]。

進一步證實miR-381-3p異常表達與宮頸癌關系,對miR-381-3p的核心基因進行驗證,結果顯示ESR1、PBX1、CCND2水平在CESC組織中低于正常組織。ESR1是編碼雌激素受體α的基因,是乳腺癌中最常見的核轉錄因子。激活ESR1配體結合結構域突變產生組成/配體非依賴性轉錄活性,并在延長一線激素治療方案后出現,這些突變對ER轉錄、轉移傾向和腫瘤微環境的多模式影響[7]。Hu等[8]研究發現ESR1通過與HS1BP3啟動子融合抑制肝癌的增殖并改善其預后。CCND2是細胞增殖的關鍵調節因子,在惡性腫瘤中起重要作用。最近研究表明,CCND2的功能異常會加速腫瘤進展。例如,CCND2調節并促進結直腸癌干細胞的細胞周期進展,抑制骨肉瘤細胞增殖和生長[9-10]。PBX1與重要的發育程序有關,其表達失調與癌癥在內的多因素疾病有關。相關研究表明 PBX1 可能參與避免免疫破壞和促進腫瘤的炎性標志物[11]。此外,本研究通過數據庫預測miR-381-3p與ESR1、PBX1、CCND2存在靶向調控關系,結合靶基因的表達水平,推測miR-381-3p參與宮頸癌的疾病進程可能與ESR1、PBX1、CCND2靶基因相關。后期,筆者結合臨床宮頸癌組織標本進一步驗證miR-381-3p與靶基因關系。

本研究發現miR-381-3p可作為宮頸癌的抑癌基因,并可能靶向ESR1、PBX1和CCND2影響宮頸癌的進展。由于ESR1、PBX1和CCND2表達與宮頸癌相關,提示它們可能為宮頸癌診斷和治療的靶點,但是仍需進一步證實miR-381-3p與宮頸癌,miR-381-3p與ESR1、PBX1和CCND2復雜作用機制。