核仁素對伯基特淋巴瘤細胞長春新堿敏感性的影響及其機制

徐偉格，郝秀君，李英新，賈鑫新，楊艷敏，原現華

邢臺市第一醫院血液科，河北邢臺054001

伯基特淋巴瘤是一種高侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤，在臨床上分為非洲地區性、散發性和免疫缺陷相關性三種流行病學亞型［1］。目前，化療仍然是伯基特淋巴瘤最主要的治療手段，而化療耐藥是導致治療失敗和預后較差的主要原因［2］。核仁素是一種多功能蛋白，廣泛分布于真核細胞的核仁、核質、細胞質和細胞膜等部位，能夠參與多種生物學過程。有研究報道，核仁素在多種腫瘤細胞中表達上調，并能調控凋亡過程中各種蛋白質分子的穩定性，從而促進腫瘤的發生、發展［3］。另外，與親本CA46細胞相比，核仁素在阿霉素耐藥的CA46細胞中表達顯著升高［4］。核仁素在腫瘤細胞中高表達，尤其是耐藥腫瘤細胞，據此推測核仁素可能與腫瘤耐藥性密切相關［5］。但核仁素參與腫瘤耐藥的機制尚不清楚。Bcl-2基因是一種抑制細胞凋亡的癌基因，其編碼蛋白屬于細胞凋亡蛋白家族。研究表明，Bcl-2蛋白過表達能夠抑制細胞凋亡，并導致血液腫瘤化療耐藥［6-7］。腫瘤細胞中核仁素和Bcl-2高表達均能參與細胞凋亡過程，它們與腫瘤細胞耐藥可能具有一定關系。2021年6月—2022年10月，本研究探討了核仁素對伯基特淋巴瘤細胞長春新堿敏感性的影響及其機制。現報告如下。

1.料與方法

1.1.料 伯基特淋巴瘤CA46細胞，購自上海博爾森生物科技有限公司。長春新堿，購自上海源葉生物科技有限公司。對照質粒（5'-CGAACGTCTACTGTCAC-3'）、核仁素shRNA質粒（5'-AGTCGTAGCTGTGAGCTG-3'）、核仁素mRNA質粒（5'-TGCACTAATGCTAGCTGTGAC-3'），由上海美迪西生物醫藥股份有限公司構建。Lipofectamine?2000轉染試劑，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RIPA裂解液，購自美國MCE公司。TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒，購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；凋亡檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術有限公司。Bcl-2、β-actin單克隆抗體及相應的二抗，購自美國CST公司。

1.2.胞培養 將CA46細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育。每2～3天換液一次。待細胞生長至85%左右融合時，0.25%胰蛋白酶消化、計數，按1∶3傳代。取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的CA46細胞進行后續實驗。

1.3.粒轉染 取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的CA46細胞，以2 × 105/孔接種于6孔板，隨機分為Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組和核仁素-OE組，每組設5個復孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育24 h，按Lipofectamine?2000轉染試劑說明，將對照質粒、核仁素shRNA質粒、核仁素mRNA質粒分別轉染至核仁素-NC組、核仁素-KD組和核仁素-OE組CA46細胞中，Control組不予轉染。轉染6 h，更換新鮮的培養基繼續培養24 h，收集細胞。

1.4.仁素、Bcl-2 mRNA表達檢測 收集上述各組CA46細胞，按總RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA。經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。然后將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：核仁素上游引物5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGC-3'、下游引物5'-TACCTTCAAACTTCGTCTTCTTTCC-3'；Bcl-2上游引物5'-CGACGACTTCTCCCGCCCGCTACCG-3'、下游引物5'-CCGCATGCTGGGGGCCGTACAGT-3'；GAPDH上游引物5'-CCTCAAGATCAGCAAT-3'、下游引物5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCCG-3'。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算核仁素、Bcl-2 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5.胞存活率檢測及長春新堿的半數抑制濃度（IC50）計算 收集上述各組CA46細胞，以5 × 103/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育24 h。然后分別加入0、25、50、100、200、400 μg/L長春新堿，繼續孵育48 h。每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，繼續孵育2 h。每孔加入DMSO溶液200 μL，輕輕振蕩，使結晶物充分溶解。酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，按公式計算細胞存活率。細胞存活率=1-［（觀察組OD450值-空白對照組OD450值）/（對照組OD450值-空白對照組OD450值）］×100%。利用SPSS21.0統計軟件計算各組CA46細胞長春新堿的IC50。

1.6.胞凋亡率檢測 收集上述各組CA46細胞，以3 × 106/孔接種于6孔板，每孔加入100 μg/L長春新堿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中孵育48 h，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃下300 × g離心5 min，收集細胞。預冷的PBS洗滌2次，1 × Binding Buffer 100 μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。最后加入1 × Binding Buffer 400 μL，混勻后置于冰盒中，1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7.cl-2蛋白表達檢測 取上述各組CA46細胞，加入適量細胞裂解液，提取細胞總蛋白。經BCA法蛋白定量合格，加入蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE分離，電泳結束后轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜。然后分別加入Bcl-2、β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發光，暗室內曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8.仁素蛋白與Bcl-2相互作用觀察 CA46細胞經RIPA裂解液充分裂解，與抗核仁素抗體和蛋白A/G磁珠交聯，以小鼠IgG作為對照抗體。將抗核仁素抗體與蛋白A/G磁珠交聯產物置于RNA免疫沉淀緩沖液，4 ℃孵育過夜。用蛋白酶K緩沖液消化磁珠中的蛋白，用苯酚、氯仿、異戊醇混合物提取和純化RNA，并將其逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠分離，GoldView染色，觀察核仁素免疫沉淀復合物中Bcl-2 mRNA條帶強度。

1.9.計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.果

2.1.組CA46細胞核仁素mRNA表達比較 Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細胞核仁素mRNA相對表達量分別為1.00 ±0.08、0.90 ± 0.05、0.30 ± 0.06、1.86 ± 0.09。Control組與核仁素-NC組CA46細胞核仁素mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細胞核仁素mRNA相對表達量低于核仁素-NC組和Control組（P均＜0.05），核仁素-OE組CA46細胞核仁素mRNA相對表達量高于核仁素-NC組和Control組（P均＜0.05）。

2.2.組CA46細胞長春新堿的IC50比較 不同濃度長春新堿干預下各組CA46細胞存活率變化見圖1。Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細胞對長春新堿的IC50分別為（143.2 ± 5.8）、（148.0 ± 4.2）、（68.3 ± 4.0）、（304.2 ± 15.7）μg/L。Control組與核仁素-NC組CA46細胞對長春新堿的IC50比較差異無統計學意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細胞對長春新堿的IC50低于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05），核仁素-OE組CA46細胞對長春新堿的IC50高于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05）。

圖1.仁素蛋白與Bcl-2 mRNA的免疫共沉淀結果觀察

圖1.同濃度長春新堿干預下各組CA46細胞存活率變化

2.3.組CA46細胞長春新堿誘導后凋亡率比較Control組、核仁素-NC組、核仁素-KD組、核仁素-OE組CA46細胞長春新堿誘導后凋亡率分別為（26.3 ±2.1）%、（28.4 ± 2.6）%、（20.5 ± 3.7）%、（75.3 ±6.8）%。Control組與核仁素-NC組CA46細胞長春新堿誘導后凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05），核仁素-KD組CA46細胞長春新堿誘導后凋亡率均低于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05），而核仁素-OE組CA46細胞長春新堿誘導后凋亡率均高于Control組和核仁素-NC組（P均＜0.05）。

2.4.組CA46細胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達比較 見表1。

表1.組CA46細胞Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

表1.組CA46細胞Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量比較（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與核仁素-NC組比較，#P＜0.05。

組別Control組核仁素-NC組核仁素-KD組核仁素-OE組Bcl-2 mRNA 1.00 ± 0.05 0.98 ± 0.02 0.41 ± 0.03*#1.59 ± 0.05*#蛋白0.78 ± 0.06 1.05 ± 0.07 0.31 ± 0.03*#1.24 ± 0.10*#

2.5.仁素蛋白與Bcl-2 mRNA的免疫共沉淀觀察 與抗IgG相比，核仁素免疫沉淀復合物中Bcl-2 mRNA顯著富集，見圖1。

3.論

伯基特淋巴瘤是一種來源于濾泡生發中心細胞的高度侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤。目前，化療仍然是伯基特淋巴瘤最主要的治療手段，而化療耐藥是導致治療失敗和預后較差的主要原因［2］。因此，改善伯基特淋巴瘤細胞對化療藥物的耐藥性并提高其敏感性是臨床亟需解決的問題。普遍認為，伯基特淋巴瘤細胞化療耐藥與基因突變、細胞凋亡異常、骨髓微環境改變等因素有關。

核仁素是一種多功能蛋白，廣泛分布于真核細胞的核仁、核質、細胞質和細胞膜等部位，能夠參與多種生物學過程。研究表明，核仁素在多種腫瘤細胞中表達上調，并且其表達與腫瘤細胞的增殖和存活密切相關［8］。臨床研究發現，核仁素在復發或難治性急性白血病預后較差患者中過表達［9］。另有研究報道，核仁素在急性白血病細胞中具有促進增殖和耐藥性進化的作用［10］。此外，有學者認為下調核仁素表達有望成為腫瘤化療增敏的有效措施之一［11-12］。有研究報道，化療藥物誘導的髓細胞白血病細胞凋亡發生之前，Bcl-2 mRNA表達下調且不穩定［13］。核仁素是否通過上調Bcl-2表達進而降低CA46細胞對長春新堿的敏感性，目前尚不明確。

本研究通過瞬時轉染技術構建了CA46細胞核仁素低表達和過表達細胞株，進一步觀察了核仁素對CA46細胞增殖、凋亡以及Bcl-2表達的影響。結果發現，長春新堿作用于核仁素過表達CA46細胞株的IC50顯著增加，說明核仁素過表達可降低CA46細胞對長春新堿的敏感性。有研究認為，核仁素表達下調可能通過降低Bcl-2表達而增強人臍靜脈內皮細胞順鉑耐藥株對順鉑的敏感性［14］。此外，核仁素抑制劑AS1411通過破壞Bcl-2 mRNA穩定性而抑制人膠質瘤和乳腺癌細胞增殖［15-16］。本研究還發現，核仁素低表達CA46細胞株Bcl-2 mRNA和蛋白表達顯著降低，核仁素過表達CA46細胞株Bcl-2 mRNA和蛋白表達顯著升高。Bcl-2基因是一種抑制細胞凋亡的癌基因，其編碼蛋白屬于細胞凋亡蛋白家族。核仁素過表達CA46細胞株對長春新堿的敏感性降低，可能與上調Bcl-2 mRNA和蛋白表達有關。本研究采用免疫共沉淀技術進一步驗證核仁素與Bcl-2在體內的相互作用，結果發現免疫沉淀復合物中Bcl-2 mRNA顯著富集，證實核仁素可與Bcl-2直接結合。

綜上所述，核仁素可能通過上調Bcl-2表達，并直接與Bcl-2 mRNA結合而促進其穩定性，從而降低伯基特淋巴瘤細胞對長春新堿的敏感性。