尋常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)變化及其與免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系

邵勇，衡鯤，代維維，王爰元

廣安市人民醫(yī)院皮膚性病科，四川廣安638000

銀屑病是一種遺傳因素與環(huán)境因素共同作用誘發(fā)并由免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。在我國銀屑病的患病率約為0.47%，現(xiàn)有患者超過700萬例。尋常型銀屑病為銀屑病最常見的類型，以局部或廣泛的點(diǎn)滴狀、斑塊狀皮損為主要表現(xiàn)，病情嚴(yán)重時(shí)還會(huì)增加克羅恩病、代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1］。異常活化的T細(xì)胞在表皮或真皮層浸潤為銀屑病的重要病理生理特征，這提示免疫系統(tǒng)參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展，而Th1/Th2變化所致的免疫失衡可能在其發(fā)病過程中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。有研究報(bào)道，微小RNA（miRNA）可能通過調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-138和miR-210是兩個(gè)參與T細(xì)胞功能調(diào)控的miRNA。已有研究報(bào)道，miR-138可參與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、哮喘等免疫相關(guān)疾病的病理生理過程［4-5］，而miR-210可參與呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等免疫相關(guān)疾病的病理生理過程［6-7］。但目前尋常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)變化及其與免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系尚不完全清楚。鑒于此，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2020年1月—2022年12月廣安市人民醫(yī)院皮膚性病科收治的尋常型銀屑病患者107例（觀察組）。尋常型銀屑病診斷依據(jù)《中國銀屑病診療指南（2018完整版）》［2］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18歲；③無體表創(chuàng)傷；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他皮膚疾病者；②合并免疫、神經(jīng)或血液系統(tǒng)疾病者；③合并惡性腫瘤者；④合并重要臟器功能嚴(yán)重?fù)p害者；⑤近2周內(nèi)接受免疫抑制劑、生物制劑、非甾體類抗炎藥等治療者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。其中，男60例、女47例，年齡27～68（40.51 ± 5.25）歲，病程3個(gè)月～10（4.18 ± 1.28）年，病情嚴(yán)重程度［2］：輕度43例、中度38例、重度26例。另選擇同期在廣安市人民醫(yī)院體檢健康的志愿者55例（對照組），男31例、女24例，年齡22～64（39.75 ± 5.33）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)廣安市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2020-1201），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2.清miR-138、miR-210表達(dá)檢測 采集所有研究對象入院時(shí)外周靜脈血4 mL，3 000 r/min離心15 min、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)Nano-300微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海劍鈍生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-138上游引物5'-GTGTTGTGAATCAGGCCGAC-3'、下游引物5'-TGATGCAACCCTGGTGTCGT-3'，miR-210上游引物5'-AGCAAACGGGATGCCTTCTCA-3'、下游引物5'-TGTTCGCCACTCGCTTCCACCAG-3'，U6上游引物5'-AATAGTGCCACGCAGTCTACA-3'、下游引物5'-CAGATGGCCTGTCTAAGGCAA-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10 μL，無核酸酶水8.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-138、miR-210相對表達(dá)量。

1.3.周血Th1、Th2細(xì)胞比例檢測 采集所有研究對象入院時(shí)外周靜脈血3 mL，加入等體積溶血?jiǎng)┫♂尯螅? 000 r/min離心20 min、離心半徑5 cm，棄上清，留取沉淀。然后分別加入抗人CD3抗體、抗人CD4抗體、FITC-抗人INF-γ抗體、PE-抗人IL-4抗體，室溫避光孵育15 min，適量PBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD4+INF-γ+（Th1標(biāo)記細(xì)胞）、CD3+CD4+IL-4+細(xì)胞比例（Th2標(biāo)記細(xì)胞），并計(jì)算Th1/Th2。

1.4.清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測 采集所有研究對象入院時(shí)外周靜脈血4 mL，3 000 r/min離心15 min、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10。試劑盒購自上海延慕實(shí)業(yè)有限公司。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較 見表1。

表1.組血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較（±s）

表1.組血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較（±s）

組別觀察組對照組t P n 107 55 miR-138 1.78 ± 0.63 3.05 ± 0.85 9.869＜0.01 miR-210 3.23 ± 0.97 1.74 ± 0.35 14.294＜0.01 Th1細(xì)胞比例（%）24.42 ± 3.46 17.71 ± 1.08 18.396＜0.01 Th2細(xì)胞比例（%）1.20 ± 0.34 2.50 ± 0.59 15.162＜0.01 Th1/Th2 22.21 ± 8.27 7.53 ± 2.17 17.236＜0.01

2.2.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較 見表2。

表2.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較（±s）

表2.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)及外周血Th1、Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2比較（±s）

注：與輕度比較，*P＜0.05；與中度比較，#P＜0.05。

病情嚴(yán)重程度輕度中度重度F P n 43 38 26 miR-138 2.27 ± 0.54 1.69 ± 0.26*1.07 ± 0.40*#130.459＜0.01 miR-210 2.48 ± 0.72 3.27 ± 0.54*4.43 ± 0.46*#170.802＜0.01 Th1細(xì)胞比例（%）21.29 ± 2.22 25.06 ± 1.63*28.69 ± 1.50*#255.307＜0.01 Th2細(xì)胞比例（%）1.51 ± 0.20 1.12 ± 0.18*0.82 ± 0.19*#215.537＜0.01 Th1/Th2 14.29 ± 2.35 23.14 ± 4.83*37.05 ± 9.36*#265.706＜0.01

2.3.組血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較 見表3。

表3.組血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較（ng/mL，±s）

表3.組血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較（ng/mL，±s）

組別nIL-2IFN-γIL-4IL-10觀察組對照組t P 107 55 37.41 ± 5.96 16.01 ± 5.44 22.954＜0.01 89.57 ± 28.99 29.47 ± 9.18 19.618＜0.01 19.82 ± 2.85 24.84 ± 3.31 9.570＜0.01 23.17 ± 3.24 32.60 ± 1.55 25.011＜0.01

2.4.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較 見表4。

表4.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較（ng/mL，±s）

表4.同病情嚴(yán)重程度尋常型銀屑病患者血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較（ng/mL，±s）

注：與輕度比較，*P＜0.05；與中度比較，#P＜0.05。

病情嚴(yán)重程度輕度中度重度F P n 43 38 26 IL-2 32.10 ± 3.71 38.56 ± 2.39*44.51 ± 3.99*#218.485＜0.01 IFN-γ 64.20 ± 18.16 94.09 ± 16.38*124.92 ± 13.21*#220.785＜0.01 IL-4 22.55 ± 1.75 18.96 ± 1.32*16.56 ± 1.29*#257.336＜0.01 IL-10 26.07 ± 1.93 22.66 ± 1.19*19.12 ± 2.06*#258.513＜0.01

2.5.常型銀屑病患者血清miR-138、miR-210表達(dá)與免疫功能和炎癥因子的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，尋常型銀屑病患者血清miR-138表達(dá)與外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及血清IL-2、IFN-γ水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.699、-0.646、-0.579、-0.680，P均＜0.01），與外周血Th2細(xì)胞比例及血清IL-4、IL-10水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.587、0.611、0.706，P均＜0.01）；血清miR-210表達(dá)與外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及血清IL-2、IFN-γ水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.657、0.675、0.654、0.643，P均＜0.01），與外周血Th2細(xì)胞比例及血清IL-4、IL-10水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.654、-0.591、-0.651，P均＜0.01）。

3.論

銀屑病是臨床常見的一種慢性炎癥性皮膚病，是遺傳、環(huán)境、免疫等因素相互作用導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和/或關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。尋常型銀屑病為銀屑病最常見的類型，占90%以上。目前，銀屑病仍無法徹底治愈，所有的治療手段僅能控制病情，并且治療周期長，易反復(fù)發(fā)作，給患者造成巨大的身心壓力，有些患者甚至出現(xiàn)抑郁、焦慮，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量［8-9］。

T細(xì)胞是來源于骨髓的多能干細(xì)胞，在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。異常活化的T細(xì)胞在表皮或真皮浸潤，能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和/或關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展［10］。Th細(xì)胞是T細(xì)胞的一種，主要分為Th1、Th2細(xì)胞，在調(diào)控機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。有研究報(bào)道，Th1/Th2變化所致的免疫失衡可能在銀屑病的發(fā)病過程中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。因此，探索尋常型銀屑病患者Th1/Th2免疫平衡相關(guān)的分子機(jī)制，對糾正Th1/Th2免疫失衡、控制病情發(fā)展、提高生活質(zhì)量具有重要意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。miRNA作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子能夠通過調(diào)控免疫功能參與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-138基因定位于人染色體3p21.32。WANG等［11］研究報(bào)道，下調(diào)miR-138表達(dá)可導(dǎo)致Th細(xì)胞和B細(xì)胞分化障礙，提示miR-138能夠參與調(diào)控Th細(xì)胞分化。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-138可參與調(diào)控咳嗽變異性哮喘、原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者Th1/Th2平衡［12-13］。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-138表達(dá)顯著低于對照組；隨著病情嚴(yán)重程度增加，尋常型銀屑病患者血清miR-138表達(dá)逐漸降低。結(jié)果提示，血清miR-138表達(dá)降低與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Th1細(xì)胞主要負(fù)責(zé)對抗細(xì)胞免疫反應(yīng)，可通過分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。Th2細(xì)胞主要負(fù)責(zé)對抗體液免疫反應(yīng)，可通過分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng)。正常狀態(tài)下，Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞相互抑制處于平衡狀態(tài)，若Th1/Th2失衡則會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化并抑制其免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展［2］。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2顯著高于對照組，外周血Th2細(xì)胞比例顯著低于對照組；隨著病情嚴(yán)重程度增加，尋常型銀屑病患者外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2逐漸升高，Th2細(xì)胞比例逐漸降低。結(jié)果提示，尋常型銀屑病患者存在Th1/Th2免疫失衡，并且隨著病情嚴(yán)重程度增加，Th1/Th2免疫失衡越來越明顯。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，觀察組血清IL-2、IFN-γ水平顯著高于對照組，血清IL-4、IL-10水平顯著低于對照組；隨著病情嚴(yán)重程度增加，尋常型銀屑病患者血清IL-2、IFN-γ水平逐漸升高，血清IL-4、IL-10水平逐漸降低。這也符合Th1/Th2失衡變化。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病患者血清miR-138表達(dá)與外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及血清IL-2、IFN-γ水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與外周血Th2細(xì)胞比例及血清IL-4、IL-10水平均呈正相關(guān)關(guān)系。這提示血清miR-138低表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)參與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-138能夠調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）有關(guān)。FU等［14］研究證實(shí)，RUNX3是免疫細(xì)胞分化的調(diào)控因子，能夠通過上調(diào)T-bet表達(dá)促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，上調(diào)miR-138表達(dá)則通過抑制RUNX3促進(jìn)銀屑病患者Th1/Th2免疫平衡。

miR-210是一個(gè)缺氧特異性miRNA，其基因定位于人染色體11p15.5。既往研究報(bào)道，miR-210表達(dá)缺失能夠通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)促進(jìn)T細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化，提示miR-210能夠參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程［15］。有研究報(bào)道，miR-210能夠通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡參與牙周炎、多發(fā)性硬化癥的發(fā)生、發(fā)展［16-17］。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-210表達(dá)顯著高于對照組；隨著病情嚴(yán)重程度增加，血清miR-210表達(dá)逐漸升高。結(jié)果表明，血清miR-210表達(dá)升高與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，血清miR-210表達(dá)與外周血Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及血清IL-2、IFN-γ水平均呈正相關(guān)關(guān)系，與外周血Th2細(xì)胞比例及血清IL-4、IL-10水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)果提示，血清miR-210高表達(dá)亦能通過調(diào)控Th1/Th2失衡介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)參與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-210能夠調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）有關(guān)。WU等［18］研究報(bào)道，STAT6是Th2細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，上調(diào)miR-210表達(dá)能夠通過下調(diào)STAT6表達(dá)抑制Th2細(xì)胞分化，導(dǎo)致銀屑病小鼠Th1/Th2免疫失衡。

綜上所述，尋常型銀屑病患者血清miR-138表達(dá)降低、血清miR-210表達(dá)升高；miR-138、miR-210可能通過調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)參與尋常型銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。但本研究結(jié)果還需進(jìn)一步證實(shí)。