慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清miR-181a和Smad7 mRNA表達變化及其臨床意義

梁穎雋，張小瑜，李小波

1 中國人民解放軍西部戰區空軍醫院呼吸與危重癥醫學科，成都610021；2 成都市第七人民醫院呼吸與危重癥醫學科

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以持續性氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病。近年來，隨著人口老齡化進程加速和環境污染加劇，我國COPD的發病率逐年上升，COPD已成為影響我國居民健康的重要公共衛生問題之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）是指在疾病過程中，短期內咳嗽、咳痰、氣短和（或）喘息加重、痰量增多，呈膿性或黏液膿性，可伴發熱或其他癥狀，是導致患者住院和死亡的重要原因［2］。因此，準確評估AECOPD及其病情嚴重程度，是COPD患者個體化評估與管理策略的關鍵。慢性氣道炎癥和氣道重塑是COPD發生、發展的病理生理基礎［3］。微小RNA（miRNA）是一類具有調控功能的內源性非編碼小分子RNA。有研究證實，miRNA能夠通過對免疫系統的調節在呼吸系統炎癥反應中扮演重要角色［4］。miR-181a是一種體內組織炎癥應激性miRNA，其基因定位于人染色體1q32.1。有研究通過加權基因共表達網絡分析發現，COPD患者外周血miR-181a異常表達［5］。Smad同源物7（Smad7）是一種重要的抑制型Smad蛋白，可通過多種途徑抑制轉化生長因子β（TGF-β）信號通路激活，進而抑制氣道炎癥反應［6］。雖然miR-181a、Smad7均能參與呼吸系統炎癥反應，但二者與AECOPD病情嚴重程度和氣道重塑的關系尚不清楚。鑒于此，本研究觀察了AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達變化，并探討二者表達變化與病情嚴重程度和氣道重塑的關系。現報告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2020年5月—2022年5月中國人民解放軍西部戰區空軍醫院呼吸科收治的AECOPD患者121例（AECOPD組）、慢性阻塞性肺疾病穩定期（SCOPD）患者45例（SCOPD組）。AECOPD和SCOPD診斷依據《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南（2018年）》［7］。納入標準：①符合AECOPD、SCOPD診斷標準；②年齡≥18歲；③病歷資料完整。排除標準：①合并肺結核、支氣管哮喘、間質性肺病等其他肺部疾病者；②合并造血系統、免疫系統、精神或神經系統損害者；③合并惡性腫瘤者；④合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；⑤既往有心、肺手術史者；⑥長期濫用藥物或有藥物依賴史者。其中，AECOPD組男85例、女36例，年齡36～87（61.85 ± 8.17）歲，BMI 18.54～28.82（22.68 ±2.19）kg/m2，病情嚴重程度［8］：輕度52例、中度46例、重度23例；SCOPD組男32例、女13例，年齡32～85（60.41 ± 7.26）歲，BMI 17.91～28.11（22.42 ±2.07）kg/m2。另選同期在中國人民解放軍西部戰區空軍醫院體檢健康的志愿者42例（對照組），男31例、女11例，年齡24～78（59.72 ± 7.16）歲，BMI 18.09～27.53（22.81 ± 1.98）kg/m2。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經中國人民解放軍西部戰區空軍醫院倫理委員會批準（批準文號：2020-02-142），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2.清miR-181a、Smad7 mRNA表達檢測 所有研究對象入組后采集空腹外周靜脈血3 mL，1 500×g離心10 min，留取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，經Nano-300微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉錄試劑盒說明，將總RNA逆轉錄合成為cDNA。以cDNA為模板，按PCR擴增試劑盒說明進行擴增。所有引物序列由上海新貝生物科技有限公司設計合成。引物序列：miR-181a上游引物5'-GTCCAGATGCTGTACCTTCCTC-3'、下游引物5'-GCGAGTCTTCTCCCCAGTAT-3'，內參U6上游引物5'-AGCGCCTTGACCTGGACA-3'、下游引物5'-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3'；Smad7上游引物5'-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3'、下游引物5'-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3'，內參GAPDH上游引物5'-CCGAGGGTCATCGATGACGT-3'、下游引物5'-ACAATTCCCACTTTGAGCTC-3'。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μL，無核酸酶水8 μL；反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃30 s、72 ℃ 15 s共40個循環。PCR反應結束，繪制熔解曲線，獲取循環閾值（CT）數。分別以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-181a、Smad7 mRNA相對表達量。

1.3.道重塑評價 所有研究對象入組后接受胸部CT掃描。取仰臥位，雙臂上舉，屈曲抱頭，采用16排螺旋CT行胸部高分辨率掃描，測量氣道腔內徑（L）、氣道腔外徑（D）、氣道壁面積（WA）、氣道總橫截面積，計算氣道壁厚度（T）與D比值（T/D）、WA占氣道總橫截面積百分比（WA%）。T/D=（D/2-L/2）/D，WA%=（氣道總橫截面積-WA）/氣道總橫截面積。

1.4.計學方法 采用SPSS28.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson或Spearman相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.果

2.1.組血清miR-181a、Smad7 mRNA表達以及T/D、WA%比較 見表1。

表1.組血清miR-181a、Smad7 mRNA表達以及T/D、WA%比較

2.2.同病情嚴重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達以及T/D、WA%比較 見表2。

表2.同病情嚴重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達以及T/D、WA%比較

2.3.ECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達與病情嚴重程度和氣道重塑的關系 Pearson相關分析顯示，AECOPD患者血清miR-181a表達與Smad7 mRNA表達呈正相關關系（r=0.716，P＜0.01）。Spearman相關分析顯示，AECOPD患者血清miR-181a表達與病情嚴重程度和WA%、T/D均呈負相關關系（rs分別為-0.662、-0.681，P均＜0.01），血清Smad7 mRNA表達與病情嚴重程度和WA%、T/D亦均呈負相關關系（rs分別為-0.667、-0.672，P均＜0.01）。

3.論

COPD是臨床最常見的慢性氣道炎癥性疾病，其病理學改變主要是氣道和（或）肺泡異常。COPD的發生通常認為與氣道和肺臟對有害顆粒或氣體的慢性炎癥反應增強有關。AECOPD不僅會加重患者主訴癥狀，還會引起多器官或系統功能損傷，是導致患者住院和死亡的重要原因［8-9］。在我國COPD患者每年發生0.5～3.5次急性加重，并且首次發生急性加重后，急性加重風險和病情嚴重程度會進一步增加，難以恢復至急性加重前狀態。但現階段臨床較多AECOPD患者病情未能及時得以評估和控制，最終引起心腦血管合并癥、呼吸衰竭甚至死亡［10］。因此，準確評估AECOPD及其病情嚴重程度，是COPD患者個體化評估與管理策略的關鍵。

氣道炎癥是COPD發生、發展的病理生理基礎之一，而持續的氣道炎癥能夠引起氣道上皮反復損傷和修復，驅動氣道重塑導致氣流受限、黏液分泌增多和肺泡被破壞，從而促進AECOPD的發生、發展［2］。近年隨著對表觀遺傳學研究的不斷深入，越來越多證據表明，miRNA能夠通過引起mRNA降解或轉錄后基因沉默參與COPD的發生、發展［4］。miR-181a是一個與炎癥反應高度相關的miRNA，可參與炎癥性疾病的發生、發展。張瑜等［11］研究報道，miR-181a能夠通過Th17/Treg抑制急性胰腺炎患者炎癥反應。LIU等［12］研究表明，miR-181a能夠靶向腫瘤壞死因子α改善糖尿病腎病的炎癥反應。在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征動物模型中發現，上調miR-181a表達能夠抑制肺部炎癥［13］。上述研究表明，miR-181a作為一種抗炎miRNA可參與AECOPD的發生、發展。本研究結果顯示，對照組、SCOPD組、AECOPD組血清miR-181a表達依次降低；隨著AECOPD患者病情加重，血清miR-181a表達逐漸降低。結果提示，血清miR-181a表達降低與AECOPD的發生、發展密切相關。

TGF-β信號通路是調節免疫炎癥反應的重要信號通路，其介導的炎癥反應與氣道炎癥密切相關［14］。Smad是TGF-β家族受體下游的信號轉導分子。Smad7是一種重要的抑制型Smad蛋白，能夠通過與轉錄抑制劑相互作用或干擾Smad-DNA復合物形成，抑制TGF-β/Smad信號通路，繼而抑制炎癥反應［6，15］。本研究結果顯示，對照組、SCOPD組、AECOPD組血清Smad7 mRNA表達依次降低；隨著AECOPD患者病情加重，血清Smad7 mRNA表達逐漸降低。結果表明，血清Smad7 mRNA表達降低與AECOPD的發生、發展亦密切相關。

T/D、WA%是臨床評估氣道重塑的常用指標。COPD患者由于氣道上皮反復損傷和修復可導致氣道重塑，故T/D、WA%會顯著升高［2］。本研究結果顯示，對照組、SCOPD組、AECOPD組T/D和WA%依次升高；隨著AECOPD患者病情加重，T/D和WA%逐漸升高。結果表明，AECOPD患者存在明顯的氣道重塑情況，并且病情嚴重程度越重，氣道重塑越明顯。

本研究相關性分析發現，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達與WA%、T/D均呈負相關關系。提示血清miR-181a、Smad7 mRNA表達降低可通過促進氣道重塑參與AECOPD病情進展。究其原因，miR-181a具有抗炎作用，其表達下調可導致氣道炎癥持續發展，從而促進氣道重塑，最終導致病情加重［16］；Smad7能夠抑制TGF-β/Smad信號通路介導的氣道炎癥，而Smad7 mRNA表達下調則導致TGF-β/Smad信號通路激活，從而促進氣道炎癥持續發展并進展為氣道重塑［17］。本研究結果還發現，AECOPD患者血清miR-181a表達與Smad7 mRNA表達呈正相關關系，提示二者可能協同促進氣道重塑繼而參與AECOPD進展。最近王雅杰等［18］研究證實，上調miR-181a表達可誘導Smad7表達上調，進而改善COPD大鼠氣道重塑。但二者協同作用的具體機制尚不清楚，還需進一步研究。

綜上所述，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表達降低，二者表達變化與病情嚴重程度和氣道重塑密切相關。