光遺傳學技術治療心房顫動的作用機制及應用研究進展

程錦瀟，王晞

武漢大學人民醫院心內科 武漢大學心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，武漢 430060

光遺傳學技術是21世紀備受關注的細胞生物學研究技術，它結合了遺傳學與光控技術，通過將光敏感蛋白特異性表達在可興奮細胞的細胞膜上，再利用特定波長的光照激活光敏感蛋白以控制離子的跨膜流動，從而實現細胞膜的去極化或超極化［1］。光遺傳學技術的起源最早可追溯到上世紀70年代，由OESTERHELT和STOECKENIUS兩位科學家在嗜鹽桿菌的紫膜上發現了一種與視紫紅質結構相似的蛋白質，在光照條件下可以被激活，將質子泵出細胞外［2］。從此，學術界針對光敏感蛋白展開了一系列的研究，其中突破最大的是BOYDEN等［3］將視紫紅質通道蛋白2（ChR2）表達在哺乳動物的神經元上，實現了光照對特定神經元的精細調控。DEISSEROTH 等［4］于次年首次提出光遺傳學這一概念，將其定義為一種將遺傳學技術與光學操作相結合，以實現光對組織器官精細調控的新技術。光遺傳學技術于2010年被正式引入心臟電生理研究，ARRENBERG等［5］和BRUEGMANN 等［6］先后將光遺傳學應用于轉基因斑馬魚及小鼠的心肌細胞，并進行心臟節律研究，從此光遺傳學技術逐漸應用于終止心律失常、光起搏和心臟再同步治療等［7］。心房顫動（簡稱房顫）是目前最常見的快速性心律失常，具有很高的致死率和致殘率［8］。復律治療不僅能有效改善患者的臨床癥狀，也能預防血栓形成，在一定程度上還能阻止房顫的自然進展，提高患者的生活質量［9］。與傳統的房顫復律措施相比，光遺傳學技術有著更高的時空分辨率，可以應用光照對心房內的異常放電部位進行調控，因而基于光遺傳學技術的房顫復律治療得到了國內外學者的廣泛關注。本文就光遺傳學技術終止房顫發作的相關機制及其應用情況作一綜述，為房顫的復律治療提供一種新的選擇。

1 光遺傳學技術治療房顫的作用機制

1.1 房顫的發病機制及“轉子”學說 房顫是一種復雜的持續性心律失常，盡管近年來學術界針對其發病機制做出了一系列的探索，但是我們對于房顫的確切發病機制仍然缺少一個明確的認識［10］。目前，被學術界廣泛認同的觀點是房顫的發生發展機制可以分為觸發機制和維持機制［11］。HAISSAGUERRE等［12］早期提出，引發房顫的異位電活動95%來自于肺靜脈肌袖，其余5%來自于上下腔靜脈。據此，環肺靜脈隔離術成為房顫導管消融的基礎術式。之后，除了腔靜脈和肺靜脈的其他心臟解剖結構，如Marshall韌帶、左心耳、右心耳、卵圓窩等，作為房顫的異位激活灶也相繼被證實［13］。然而，心腔的異位電激活并不是引起房顫發作的充分必要條件，有研究表明正常人的心臟內也會發生異常電活動［14］。房顫被觸發之后，其發作具有不確定性，有的發作是短暫的，有的發作是持續性的，甚至在沒有異位激活的時候仍然可以出現房顫的發作［9］。所以房顫的形成除了有觸發因素之外，維持因素的存在也起到了不可忽視的作用。目前廣泛認可的房顫維持機制有“多子波折返”學說、局灶驅動伴顫動樣傳導以及近年來備受關注的“轉子”學說。轉子是一種螺旋形、雜亂無章的電活動，圍繞著一個不可激發的核心［15］。在離體心臟實驗中已經證明了轉子的存在，單個轉子可以引起單形性快速心律失常，額外的轉子可以引起多形性快速心律失常［16］。最近的研究表明，光遺傳學可以對心房內的轉子進行操控，利用轉子可漂移的特性對其進行靶向消除［17］。

1.2 光遺傳學技術對轉子的消除作用 轉子是心肌組織中圍繞著一個不可激發的核心而形成的一種呈螺旋形且雜亂無章的電活動，目前轉子被廣泛認為是房顫發生的驅動灶。心肌組織的興奮性改變可以導致轉子核心的移位，奠定了光遺傳學技術消除轉子治療房顫的可行性。FEOLA等［18］將ChR2表達在新生大鼠心房肌細胞（nraCMC）上，隨后通過S1-S2光交叉場刺激，在大鼠心房肌細胞上成功誘導出單個、穩定、集中的轉子，然后通過精確的光定位在轉子的核心或者周邊區域誘導出圓形或條塊狀的光傳導塊；當在轉子核心區域被局部照射誘導出圓形光傳導塊時，出現到了兩種同時發生的現象，即出現了一個新的電波和形成了功能性傳導阻滯；在光傳導塊的作用下，新的電波與現有轉子激活的前沿發生碰撞，因而產生了新的折返波，新的折返波被錨定到被誘導功能性傳導阻滯的照明區，從而維持心律失常活動。所以，在轉子核心區域局部照射誘導出圓形光傳導塊時沒有終止轉子，而是將轉子核心區靶向轉化一種新的折返回路；隨后在轉子核心區域誘導出經過核心的條塊狀光傳導塊時，出現了與之前一樣的現象；但是當FEOLA等［18］將nraCMC上光傳導塊的長度延長至穿過核心，并達到至少一個不可激發的邊界時，轉子沿著傳導塊向不可激發的邊界漂移，并與之發生碰撞而消失。因此，轉子漂移的機制可能是持續局部光照導致心肌細胞興奮性降低而產生了一個興奮性梯度，使得轉子向興奮性低的地方漂移。隨后，MAJUMDER等［19］通過光誘導興奮性梯度誘導了兩個轉子的對向移動，使得轉子核心區域發生碰撞，結果兩個轉子核心相互碰撞之后轉子也隨之消失。以上實驗證明，光遺傳學技術可以通過誘導產生局部光傳導塊而終止房顫，但是需要傳導塊經過轉子核心，且到達至少一個不可激發的邊界的塊狀線，又或者可以通過誘導轉子間的碰撞而終止房顫，這一重大發現提高了光遺傳學技術對轉子消融機制的理解。

2 光遺傳學技術在房顫治療中的應用

目前，房顫的復律治療可以通過填充心肌的可興奮間隙來恢復竇性心律，并阻止心律失常的傳播。可興奮間隙是指上一個異位起搏點引起的去極化心肌組織和下一個異常電信號引起去極化的心肌組織之間的可興奮但未興奮的心肌組織。可興奮間隙也可以通過增加心臟波長來減小，而心臟波長是傳導速度和動作電位持續時間（APD）的乘積。通過延長APD持續時間的光遺傳學操作可以實現填充可興奮間隙，從而終止房顫發作。心臟電復律通過一定強度的電擊，導致大量心肌細胞除極，并延長隨后的動作電位，從而使心肌細胞對下一個心律失常無反應。但是，電復律存在若干個缺點：①電流誘導的去極化電流是廣泛且瞬時的；②治療過程需要使用鎮靜劑來減輕患者的痛苦，增加了電復律的局限性；③除顫波對心肌細胞膜電位有不均勻影響，增加了超極化細胞的數量，導致心肌細胞之間出現電位梯度，從而引發心律失常再次形成。相比于電除顫，光遺傳學技術可以產生連續、無痛的去極化電流，且不會破壞心肌和周圍組織。因此，我們有理由認為光遺傳學技術為房顫的復律治療提供了一種全新的選擇。我們將從離體實驗、在體實驗以及計算機模擬實驗三個方面闡述光遺傳學技術在終止房顫發作中的研究進展。

2.1 光遺傳學技術在離體實驗中終止房顫發作在離體實驗，最開始由BINGEN等［20］將CatCh表達在新生大鼠心肌細胞單層，通過突發電起搏以誘導圍繞功能核心旋轉的螺旋波，并利用多電極陣列MEA研究CatCh激活對折返回路的影響。該研究團隊首先用10 ms脈沖的470 nm藍光照射心肌細胞，結果僅在表達CatCh的心肌細胞單層中激發了動作電位，隨后將光脈沖延長至500 ms，發現在31個表達了CatCh的單層心肌細胞中折返回路全部被終止，而沒有表達CatCh的心肌細胞單層中折返回路對光照無反應；這提示心肌細胞單層中的螺旋波可被光誘導的去極化電流終止，為非電擊除顫提供了概念驗證。之后NUSSINOVITCH等［21］將光敏感的超極化質子泵ArchT表達在人胚胎腎細胞293（HEK293）上，隨后將ArchT-HEK293細胞與新生大鼠心肌細胞（NRCMs）或人胚胎干細胞源性心肌細胞（hESC-CMs）共同培養形成串聯細胞單元，之后應用多電極陣列MEA記錄聚焦的590 nm黃光照射細胞之前、期間、之后的傳導和變時特性；結果顯示光照之后NRCMs的電活動完全被沉默，導致大鼠心肌細胞中局部傳導阻滯的發展；在光照下的hESC-CMs自發搏動顯著減慢，由光照前的（86 ± 9）次/分降低至光照后的（20 ± 4 ）次/分，證明超極化視蛋白被激活能穩定膜電位，消除心律失常的傳播，在離體心肌細胞中可有效終止房顫。

2.2 光遺傳學技術在在體實驗中終止房顫發作BRUEGMAN等［22］將表達ChR2（H134R）的轉基因小鼠與房顫易感的連接蛋白40雜合突變（Cx40 Ala96Ser）小鼠進行雜交，以此構建出新的光遺傳學房顫易感的小鼠品系；將該品系小鼠心臟取出，灌注低鉀泰氏液體和KATP通道激活劑以誘發持續性房顫，隨后通過聚焦藍光（470 nm，0.4 mW/mm2）照射心外膜；結果顯示，相較于不表達光敏感蛋白的對照組小鼠，光遺傳學房顫易感的小鼠離體心臟經過光照后房顫被有效終止。當光遺傳學技術被證實在離體實驗中可以用于終止房顫發作之后，BRUEGMANN等［22］開始研究在體實驗中的光遺傳學技術復律治療，他們用攜帶ChR2的腺相關病毒來轉染小鼠的心臟，6 ～ 8個月后將小鼠麻醉后開胸，用靜脈刺激導管在心內膜處予以Burst刺激，以誘發小鼠房顫發作，隨后用心外膜照射的方式觀察房顫的終止情況，結果顯示在首測的7只小鼠中有6只能通過光照終止房顫。同樣，近期發表的一項研究通過重組腺相關病毒［rAAV9-CAG-hChR2（XXM）-eYFP］轉染SD大鼠心肌細胞，通過Burst刺激（6 V、20 ms、2 ～ 4 s）誘發房顫后，對心房施加4個間隔1 s的光脈沖，觀察光照能否有效終止房顫；結果顯示，光照后大鼠房顫終止率明顯升高，房顫的持續時間也明顯縮短，證明光照能有效地在體內終止房顫的進展［23］。以上兩項研究證明，光遺傳學技術可以有效終止在體小鼠、大鼠的房顫發作。

2.3 光遺傳學技術在計算機模擬實驗中終止房顫發作 為研究光遺傳學的轉化潛力，BOYLE等［24］選擇了3例房撲伴纖維化患者，創建了由晚期Gd增強MRI掃描重建的特定患者模型，并模擬了ChR2表達，隨后對每個模型分別采用分散式照明和定向照明；結果發現，分布式照明的房性心動過速（AT）終止率很低，AT終止率從短脈沖（1 ～ 10 ms）的不足5%到長脈沖（100 ～ 1 000 ms）的20%左右；但是當實驗人員嘗試使用定向照明終止相同的AT發作時，短脈沖的結果相似（AT終止率0%），但是長脈沖的結果明顯有所改善（AT終止率為54% ～ 90%）。因此，計算機模擬實驗有效地證明，持續時間長于房速周期長度的光脈沖可以有效終止房顫發作，這也為光遺傳學技術復律治療的臨床轉化提供了依據。

綜上所述，心臟光遺傳學技術是一種有潛力的房顫復律治療手段，特別是在年輕、癥狀明顯、藥物耐受和心力衰竭患者中，光遺傳學技術可能會使患者受益。但是，在考慮將這一項技術用于臨床之前，有幾個挑戰需要解決，比如光敏感蛋白的選擇、光敏感蛋白的傳遞策略和載體選擇，以及人體對載體和光敏感蛋白的免疫反應等［25］。理想化載體的發現以及將光信號無創、有效地傳遞給靶細胞是目前光遺傳學轉化研究的重點難題。病毒是目前最常用的基因載體，腺相關病毒（AAV）是基礎研究和臨床試驗中最廣泛使用的病毒工具之一。AAV為野生型病毒，雖然沒有致毒潛力，但是我們仍需要考慮到病毒的免疫原性［26］。由于AAV在人類中普遍存在，大多數的患者攜帶AAV抗體，因此開發一個不引起免疫反應或者輕度免疫反應的病毒株或血清型是有必要的［27］。另外，一些非病毒載體的研發也為光遺傳學技術轉化研究提供了一絲曙光，但是其不良反應仍然沒有太多文獻報導。有效的光信號傳遞是光遺傳學技術臨床應用的另一大挑戰。在傳統的心臟光遺傳學基礎研究中，通常采用心包外的可見光照射，而心內膜光信號傳導仍然未得到有效解決。同樣，在跳動的心臟中提供適當的照明也是相當困難的，目前雖然可以通過植入微型LED裝置來解決這一難題，但是其長期適用性仍有待考證。此外，光照產生的熱量會導致心臟產生程度不一的化學損傷和熱損傷，化學損傷可通過產生黃素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和黑色素而引發［28］；熱損傷的產生可能會導致不可逆的細胞損傷，并引發新的心律失常［29］。另外值得注意的是，目前大多數研究是關于心肌細胞單層和計算機模擬實驗的，在活體心臟中的研究相對較少。因此，還需要更多的試驗來確定心臟光遺傳學技術在人體內的安全性，以及光遺傳學技術在人體應用的具體光學參數。雖然目前報道顯示機體對載體和視蛋白的免疫反應很小，但是仍然需要足夠多的試驗數據來保證光遺傳學技術的安全性和可行性。光遺傳學使得基礎研究科學家和臨床醫生能夠精確地操縱細胞電活動，未來在心臟電生理領域中的研究重點是在人體中安全有效地調控心臟電活動。然而實現這一目的仍然還有很長的路要走，考慮到以上難題，光遺傳學技術的臨床轉化研究還需要經過長時間的實踐探索。