銀杏葉提取物對結腸癌患者SW480細胞增殖的影響

關毅，暢立強

1.新疆五家渠第六師總醫院普外一科，新疆五家渠 831300；2.山西省中醫藥研究院肛腸科，山西太原 030001

結腸癌發生原因復雜多樣，涉及遺傳、環境、生活方式等因素[1]。結腸癌通常發生在50歲以上的人群中[2]，年齡是結腸癌的一個重要危險因素。男性比女性更容易患結腸癌。結腸癌是一種惡性腫瘤，如果不及時治療，腫瘤會繼續生長和擴散，甚至會引起腸梗阻、穿孔和腹膜轉移等嚴重后果，對患者的健康造成嚴重的危害。且結腸癌的早期癥狀不明顯，可能只有輕微的腹瀉、腹痛或不適，或者沒有任何癥狀。一旦病情發展到晚期，治療難度會增加，患者的生存率也會大大降低[3-4]。因此，對結腸癌而言，最關鍵的是采取高效的治療藥物或方式進行治療。銀杏葉提取物是當前臨床治療結腸癌的一種常用藥物成分[5]。為此，本文選擇2022年1—12月新疆五家渠第六師總醫院的10份結腸癌標本為研究對象，就銀杏葉提取物對結腸癌患者SW480細胞增殖的影響進行臨床研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

選擇本院10份結腸癌標本為研究對象，以及中國南京博瑞公司所產的銀杏葉提取物EGB761，濃度稀釋所用的材料為二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）。另準備南通碧云天生物科技公司所產的高糖DMEM培養基、細胞增殖和毒性檢測劑盒（CCK-8）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、RIPA細胞裂解液、胰蛋白酶溶液，同時使用美國Santa Cruz公司所產的兔抗人多克隆抗體Ki67和小鼠抗人單克隆抗體PCNA以及江蘇南通碧云天生物科技公司生產的β-actin抗體。

1.2 方法

在檢測銀杏葉提取物EGB761對結腸癌細胞SW480的細胞增殖抑制率之前，預先制備1×105/mL的細胞懸液并將其接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液。經過24 h的37℃、5%CO2培養，每孔分別加入0.5 mg/mL不同質量的銀杏葉提取物為銀杏葉提取物組，劑量分別為20、40、60、80、100 μL，從而獲得100、200、300、400、500 mg/L的濃度，上述的每個濃度都設置了3個重復孔，另設對照組（DMSO），數量與以上相等。將相應的空白孔調零，操作人員將不同濃度的銀杏葉提取物分別處理細胞2 d、3 d后，在每個孔中將10 μL CCK-8試劑加入并培養3 h，之后對各孔的吸光度（optical density,OD）值進行檢測，檢測時的酶標儀波長為450 nm，同時將培養液作為空白對照并調零。最后，通過計算細胞增殖抑制率（inhibition rate, IR），即IR=（1-各銀杏葉提取物組吸光度均值/空白對照組吸光度均值）×100%，來比較不同濃度銀杏葉提取物對細胞增殖的影響。每個樣本均測量了3次并取平均值，以評估不同組之間的差異。

Western Blot的具體檢測方法為：用RIPA細胞裂解液提取不同組別的SW480細胞總蛋白，然后用分光光度儀測量蛋白質濃度。接下來，將蛋白樣品進行加熱變性處理，然后進一步實施聚丙烯酰胺凝膠電泳，成功完成電泳操作之后間蛋白質轉移至PVDF膜上封閉處理2 h，再將兔抗人Ki67和羊抗人PCNA的一級抗體加入，在4℃過夜后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的鼠抗兔及鼠抗羊二級抗體室溫下孵育0.5 h。經PBS洗滌3次后，用ECL發光顯影方法檢測蛋白質的表達情況。

1.3 觀察指標

①100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后其吸光度、抑制率，并與空白對照組比較；②比較不同濃度下活性氧（reactive oxygen species,ROS）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP）mRNA表達水平。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度銀杏葉提取物對結腸癌SW480細胞增殖抑制率的影響

200、300、400、500 mg/L濃度時的吸光度與空白對照組比較，差異有統計學意義（t=4.106、11.474、12.135、13.966，P＜0.05）。100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的抑制率分別與空白對照組比較，差異有統計學意義（t=76.963、31.821、29.747、29.461、33.614，P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度銀杏葉提取物對結腸癌SW480細胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 不同濃度銀杏葉提取物對結腸癌SW480細胞增殖抑制率的影響(±s)

注：*與空白對照比較，P＜0.05。

項目吸光度450抑制率（%）空白對照組（n=10）1.125±0.139 0.002±0.001銀杏葉提取物組（n=10）100 mg/L 1.145±0.214（3.020±0.124）*200 mg/L（0.943±0.018）*（12.500±1.242）*300 mg/L（0.616±0.017）*（40.000±4.252）*400 mg/L（0.571±0.039）*（43.100±4.626）*500 mg/L（0.508±0.014）*（45.200±4.252）*

2.2 各組ROS 、XIAP mRNA 表達水平比較

100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的ROS、XIAP mRNA表達水平與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組ROS、XIAP mRNA 表達水平比較(±s)

表2 各組ROS、XIAP mRNA 表達水平比較(±s)

注：*與空白對照比較，P＜0.05。

項目ROS（ng/μl）XIAP mRNA空白對照組（n=10）213.73±14.64 6.26±0.63銀杏葉提取物組（n=10）100 mg/L（263.46±16.79）*（5.89±0.52）*200 mg/L（295.76±20.37）*（5.24±0.53）*300 mg/L（362.63±21.88）*（4.36±0.45）*400 mg/L（475.45±22.74）*（3.36±0.75）*500 mg/L（503.55±23.39）*（2.86±0.22）*

3 討論

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，成為了全球健康領域的重要問題。隨著近年臨床對結腸癌的深入研究發現，結腸癌的發生發展與SW480細胞增殖有著密切的聯系，而銀杏葉提取物能夠有效地抑制SW480細胞增殖，因此對結腸癌具有良好的治療效果[6-7]。

SW480細胞是一種人類結腸腺癌細胞株，最初是從1例50歲男性的腸癌組織中分離而得，研究表明，SW480細胞具有以下特點：①高度惡性，SW480細胞具有高度的轉移和浸潤性，是一種典型的惡性腫瘤細胞。②易于培養，SW480細胞可以在體外培養，增殖迅速，適合進行細胞實驗。③易于轉染，SW480細胞對轉染和轉化病毒非常敏感，使其成為研究癌基因和腫瘤抑制基因的理想細胞模型[8-9]。

SW480細胞的快速增殖和易于轉染等特點使其成為研究結腸癌和腫瘤生物學的理想細胞模型，歸納起來，SW480細胞在結腸癌研究中的應用主要體現在以下幾個方面：①藥物篩選，SW480細胞可以用于篩選針對結腸癌的藥物，并評估其抑制腫瘤細胞增殖的效果[10]。②基因功能研究，SW480細胞對轉染和轉化病毒敏感，可以用于研究癌基因和腫瘤抑制基因的功能和相互作用。③信號通路研究，SW480細胞是Wnt/β-catenin通路過度激活的典型模型，可以用于研究該通路在結腸癌發生和發展中的作用。④腫瘤免疫學研究，SW480細胞可以用于研究腫瘤免疫學，包括研究腫瘤細胞的免疫逃逸機制和開發針對腫瘤的免疫治療方法[11-12]。

銀杏葉提取物是一種天然藥物，已廣泛應用于許多疾病的治療。銀杏葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥和免疫調節等多種生物學活性，近年來臨床發現[8]，銀杏葉提取物對SW480細胞增殖有著很大的影響。歸納起來，銀杏葉提取物主要通過以下幾個方面對SW480細胞增殖發揮作用：①抑制細胞周期，銀杏葉提取物可能通過抑制細胞周期來抑制SW480細胞的增殖。一項研究發現，銀杏葉提取物可以抑制SW480細胞進入G2/M期，從而阻礙其細胞分裂和增殖。②誘導凋亡，銀杏葉提取物可能通過誘導細胞凋亡來抑制SW480細胞的增殖。

孫小虎等[13]在其研究報道中稱，銀杏葉提取物可以通過調節Bax/Bcl-2比值來誘導SW480細胞的凋亡；也可抑制Wnt/β-catenin通路，Wnt/β-catenin通路在結腸癌的發生和發展中起著重要作用。

相關研究表明，銀杏葉提取物可以通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制SW480細胞的增殖[14]。因此，銀杏葉提取物能有效抑制結腸癌患者SW480細胞增殖，并且可能通過多種作用機制來發揮其生物學活性，同時，不同的濃度所產生的效果也各不相同，通常情況下是在400 mg/L以上時抑制效果最佳，本研究結果顯示，在100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后其吸光度持續下降，200、300、400、500mg/L濃度時的吸光度與空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），100、200、300、400、500 mg/L濃度銀杏葉提取物處理后的抑制率持續升高，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與以上結論相符，進一步證實了銀杏葉提取物能有效抑制結腸癌患者SW480細胞增殖。

李靈等[15]表明，在400 ml/L濃度時，ROS通常可達到480 ng/μl左右，XIAP mRNA則可控制在3.5左右。在本次研究中，不同濃度下ROS、XIAP mRNA表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05），分析其原因，ROS在細胞中發揮重要的生理功能，例如調節細胞增殖和凋亡等過程。然而，過量的ROS會導致細胞損傷和氧化應激，進而引發細胞死亡，在腫瘤細胞中，細胞內ROS水平的增加可以誘導細胞凋亡，并對腫瘤的發展產生抑制作用。XIAP是一種抑制細胞凋亡的關鍵蛋白質，能夠與多種凋亡信號通路的關鍵蛋白相互作用，抑制細胞凋亡的進行。在腫瘤細胞中，XIAP的過度表達與抗凋亡能力的增強以及腫瘤細胞的耐藥性相關。銀杏葉提取物可以影響結腸癌SW480細胞中的ROS水平和XIAP信號通路。而銀杏葉提取物的抗氧化特性則能夠增加細胞內ROS的生成或抑制ROS的清除，從而破壞細胞內的平衡狀態，誘導細胞凋亡的發生。此外，銀杏葉提取物還能夠下調XIAP的表達水平，減少其與凋亡信號通路關鍵蛋白的結合，從而解除對細胞凋亡的抑制作用，這一結論也與李靈等[15]所報道的結果相符。

綜上所述，銀杏葉提取物可對結腸癌SW480細胞的增殖表現為濃度和時間依賴性地抑制。