一步法固相萃取結合液相色譜-串聯質譜法測定鱸魚中孔雀石綠

覃弘毅 李琬婧

摘 要：建立一種一步法固相萃取結合液相色譜-串聯質譜法同時測定鱸魚中孔雀石綠殘留的分析方法。樣品經乙腈和水鹽析提取后，通過EMR-lipid凈化，經Eclipse plus色譜柱分離后，在正離子模式（ESI+）下采集信號，以內標法定量。結果表明，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的線性范圍為0.1～2.0 ng·mL-1，相關系數r在0.999以上，定量限為0.04 μg·kg-1，加標回收率為93.6%～107.5%，相對標準偏差（n=6）為1.4%～4.0%。本方法經方法學驗證，操作簡單、準確度高，定量限滿足限量要求，可為鱸魚中孔雀石綠的定量分析提供參考。

關鍵詞：鱸魚；孔雀石綠；液相色譜-串聯質譜法；一步法固相萃取

Abstract： A method for the determination of malachite green residues in bass fish by one step solid phase extraction combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry. The sample was extracted by acetonitrile and water， after salting out， then cleaned up by solid phase extraction procedure using EMR-lipid. After chromatographic separation by Eclipse plus column， determination was accomplished in the positive ionization mode. Target substances were quantified by internal standard method. Through the protocol， the standard curve was linear in 0.1～2.0 ng·mL-1， linear correlation coefficients were above 0.999， limits of quantitation were 0.04 μg·kg-1. The recoveries ranged from 93.6% to 107.5%. Relative standard deviations （n=6） were in the range of 1.4% to 4.0%. This method has been verified for its simplicity and accuracy， and the limits of quantitation meets the limit requirements. It can provide a reference for the quantitative analysis of malachite green residues in bass fish.

Keywords： bass fish; malachite green; liquid chromatography tandem mass spectrometry; one step solid phase extraction

孔雀石綠是一種三苯甲烷類染料，可用來殺寄生蟲和滅菌，早期被廣泛運用在水產養殖行業。然而人們長期超量食用含孔雀石綠殘留的食物容易致癌。根據我國農業農村部第250號公告的清單，孔雀石綠在食品動物中禁止使用。現市面上還沒有其他特效藥能在短時間內治愈水產養殖業中常見的水霉病，因此一些養殖戶仍選擇使用孔雀石綠，導致其超標率較高[1-2]。

目前，在我國日常食品安全監督抽檢中，主要使用GB/T 19857—2005對水產品中的孔雀石綠進行檢驗，但實驗操作中使用甲醇水體系提取，基質復雜，且中性氧化鋁柱凈化效果有限，造成檢出限低的現象[3]。因此，急需建立一種靈敏度高且快速準確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30份鱸魚樣品（購自本地農貿市場）；孔雀石綠、隱色孔雀石綠、孔雀石綠D5、隱色孔雀石綠D6標準溶液（1 000 μg·mL-1，美國First standard）；EMR-lipid固相萃取柱（500 mg/6 mL，美國Agilent）；乙腈（HPLC，德國Merck）；氯化鈉（優級純、上海滬試）；甲酸（HPLC，德國Merck）；0.2 μm針式濾器（親水PTFE、美國Agilent）；水（由Millpore超純水機制備）。

1.2 儀器與設備

液相色譜-串聯質譜儀（日本Shimazu LC-30A+美國Sciex TripleQuad 4500）；渦旋振蕩器（德國IKA MS3）；冷凍離心機（德國Sigma 2-16 KL）；全自動樣品濃縮儀（瑞典Biotage TurboVap）；電子天平（瑞士梅特勒 XS205DU）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

（1）提取。稱取5 g試樣（精確至0.01 g）置于50 mL聚丙烯離心管中，加入40 μL內標混合使用液（100 ng·mL-1），再加入5 mL水，渦旋振蕩1 min，使樣品均勻分散。再加入8 mL乙腈和3 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min進行提取，于4 000 r·min-1下離心5 min。取4 mL上清液，加入1 mL水，混合均勻，待凈化。

（2）凈化。取待凈化液直接過EMR-lipid固相萃取柱，讓洗脫液隨重力自然滴下，收集全部洗脫液，氮吹濃縮至1 mL以下，用水稀釋至1 mL，渦旋10 s溶解殘渣，過0.2 μm親水性聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene，PTFE）濾膜，上機分析。

1.3.2 標準溶液配制

分別精密移取孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其內標標準溶液（1 000 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀釋至100 mL，制成各自的標準儲備液（10 μg·mL-1），-18 ℃避光條件下保存。再分別精密移取孔雀石綠、隱色孔雀石綠標準儲備液（10 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀釋至100 mL，制成外標混合使用液（100 ng·mL-1）。分別精密移取孔雀石綠D5、隱色孔雀石綠D6標準儲備溶液（10 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀釋至100 mL，制成內標混合使用液（100 ng·mL-1）。

精密移取外標混合使用液（100 ng·mL-1）10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL，再依次加入內標混合使用液（100 ng·mL-1）200 μL，用乙腈稀釋至10 mL，相應稀釋成外標濃度為0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1，內標濃度均為2 ng·mL-1的標準工作曲線溶液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：安捷倫Eclipse plus（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃；流動相A：含0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；洗脫梯度：0～0.5 min，90%A；0.5～1.4 min，90%→10%A；1.40～1.41 min，10%A→90%A；1.41～2.00 min，90%A。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI+）；多反應離子監測；離子源溫度：550 ℃；電噴霧電壓：5 500 V；氣流量（氣簾氣：30 psi；霧化氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi）。質譜參數詳見表1。

2 結果與分析

2.1 標準物質的離子色譜圖

孔雀石綠、隱色孔雀石綠及2種內標物質的離子色譜圖見圖1。

2.2 前處理條件的優化

在提取階段，在提取步驟中采用渦旋振蕩取代了均質，避免重復使用均質刀頭而產生交叉污染；提取溶劑使用乙腈和水的混合溶液，能有效地分散樣品，提高提取效率，并添加了氯化鈉，以增加水相的比重，使乙腈和水的混合溶液能有效分層，起到鹽析的作用，獲得純乙腈上清液，有利于控制上柱溶液中乙腈水比例的穩定，也可以使大部分經水提取出的雜質留于水相中，減少后續凈化過程的凈化壓力。

在凈化階段，與GB/T 19857—2005相比，采用了新型的EMR-lipid取代了傳統的中性氧化鋁作為固相萃取的填料，該填料屬親水親脂型吸附材料，可直接上樣，采用通過式吸附的凈化原理，使固相萃取無需再經過活化平衡步驟，該法可實現“一步法凈化”，在保證準確度和凈化效果的同時，極大地縮短前處理時間[4]。

在過濾階段，常用的濾膜材料有疏水性材料尼龍和親水性材料聚醚砜。由于孔雀石綠和隱色孔雀石綠屬于脂溶性染料，如使用尼龍，樣品溶液水相比例較大，會加大過膜壓力，過濾效果不理想，而且孔雀石綠極易被吸附于過濾的濾膜上，導致實驗失敗；親水性材料聚醚砜在使用中也會對孔雀石綠有一定的吸附，降低檢測的靈敏度。而PTFE惰性極強，與物質幾乎不發生反應，能達到僅過濾顆粒物雜質的效果，因此是理想的過濾材料。故本文使用新型親水PTFE濾膜取代了傳統聚醚砜濾膜，最大程度保證孔雀石綠在過濾階段不流失。

2.3 線性范圍、定量限、回收率和精密度

標準工作曲線溶液上機分析后，以外標和內標的峰面積比值作為縱坐標，外標的濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，線性范圍及相關系數見表2。

取空白樣品5 g，添加外標混合使用液（100 ng·mL-1）2 μL，使得最終樣品溶液濃度處于線性最低點（0.1 ng mL-1）。經測定，其信噪比（S/N）＞10，滿足定量限要求，故以線性最低點處對應的樣品含量0.04 μg·kg-1作為定量限。在加標回收實驗中，選取1倍定量限、5倍定量限和10倍定量限3個濃度水平進行加標，每個濃度水平做6個平行樣，結果均滿足GB/T 27417—2017中關于方法確認的要求[5]。

2.4 實際樣品測定

取本地農貿市場售賣的30份鱸魚樣品進行實際樣品測試，其中檢出2批次孔雀石綠和隱色孔雀石綠，該方法結果與GB/T 19857—2005方法的結果比較，兩個方法間孔雀石綠和隱色孔雀石綠結果的絕對差值占算數平均值的百分比分別為5.6%～8.6%和4.9%～9.5%。取中國檢驗檢疫科學研究院提供的魚肉質控樣進行測試，本方法孔雀石綠和隱色孔雀石綠總量的測定結果|Z|值為0.6，滿足測量值范圍|Z|值≤2的要求。

3 結論

本文以常見的鱸魚為分析樣本，建立了以孔雀石綠為分析目標物的檢測方法。該方法使用新型填料取代傳統填料，準確度高，重復性好，實驗速度快，定量限等指標均滿足現行標準的檢測要求。在食品安全檢驗中，可提供篩查鱸魚中違法添加孔雀石綠的檢測技術手段。

參考文獻

[1]福建省疾病預防控制中心.孔雀石綠的危害，了解一下[EB/OL].（2020-09-08）[2023-06-09].http：//www.fjcdc.com.cn/show？ctlgid=152616&Id=17572.

[2]中華人民共和國農業農村部.中華人民共和國農業農村部公告 第250號[EB/OL].（2019-12-27）[2023-06-09].http：//www.moa.gov.cn/govpublic/xmsyj/202001/t20200106_6334375.htm.

[3]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢驗總局，中國國家標準化管理委員會.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定：GB/T 19857—2005[S].北京：中國標準出版社，2005.

[4]陳小華，汪群杰.固相萃取技術與應用[M].北京：科學出版社，2010.

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.合格評定 化學分析方法確認和驗證指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.