安徽部分地區湖羊呼吸道病原微生物鑒定

黃媛媛,譚美玲,薄瑞紅,余承波,張美詩,楊長根,王 福,趙家喜,余杞強,阮祥春,6*

(1.安徽農業大學動物科技學院,安徽合肥 230036;2.望江縣小月山農業發展有限公司,安徽望江 246200;3.霍山縣畜牧產業發展中心,安徽霍山 237200;4.望江畜牧獸醫技術推廣中心,安徽望江 246200;5.宿松縣農業綜合技術推廣服務中心,安徽宿松 246500;6.獸醫病理生物學與疫病防控省級重點實驗室,安徽合肥 230036)

湖羊主要產于浙江嘉興和太湖地區,成年公羊體重40～50 kg,母羊35～45 kg,耐熱、耐濕,慣舍飼,成熟早,肉質好,母羊終年發情,繁殖力高。近年來,隨著長三角地區產業轉移速度的加快和安徽省皖江城市帶承接產業轉移示范區的建設,長三角地區湖羊養殖快速向安徽省內轉移[1],湖羊在安徽省的養殖數量和規模隨之不斷增加。

舍飼是湖羊的基本飼養方式。集約化養殖使得羊群密度增加,因飼養管理水平和防疫措施不到位,導致羊病的發生和流行呈上升趨勢。其中,以羊的呼吸道疾病尤為常見。羊呼吸道疾病的發生通常是由多種細菌引起的,常見的有多殺性巴氏桿菌、鏈球菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯氏菌、溶血性曼氏體、卵形肺炎梅氏桿菌等。它們主要存在于羊的上呼吸道,在機體感染其他呼吸道致病菌后侵入下呼吸道,引起羊的慢性和持續性的咳嗽、呼吸困難、流涕和打噴嚏,部分可見急性纖維素性肺炎等主要臨床癥狀,此外還伴有不同類型的發熱、精神沉郁、飲食欲減退或廢絕、生長緩慢等,嚴重者往往還存在混合感染和繼發感染現象,使得疾病呈現復雜化[2-6]。

為了解湖羊呼吸道病原微生物的種類及分布情況,筆者在安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個羊場共采集湖羊上呼吸道鼻拭子樣本598份,進行細菌分離純化及鑒定,為湖羊呼吸道疾病的臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2021年12月,在安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個不同規模化養殖場,按照90%的置信區間,共采集4—8月齡湖羊鼻拭子樣本598份。樣本保存于裝有1 mL胎牛血清LB肉湯的2 mL滅菌離心管中,2～8 ℃保存備用。

1.2 病原菌分離純化及形態學鑒定用接種環于離心管中蘸取胎牛血清LB肉湯,采用四區劃線法接種于胎牛血清LB營養瓊脂和腦心浸液瓊脂培養基,挑選單菌落純化,于恒溫培養箱中37 ℃培養24 h,觀察記錄菌落生長情況。待菌落長成,在超凈臺中挑取單菌落,用無菌水稀釋,在載玻片上進行涂片、干燥、固定,然后進行革蘭氏染色,鏡檢,觀察細菌形態特征。

1.3 病原菌分子鑒定用接種環挑取形態學無法鑒別的病原菌菌落于50 μL Lysis Buffer 中,80 ℃恒溫水浴鍋加熱15 min,DNA提取完后保存于-20 ℃中備用。將提取的DNA用16S rDNA通用引物(27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3;1492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)進行PCR擴增目標序列。采用25 μL 反應體系,即上游引物、下游引物各1 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)9.5 μL,ddH2O 12.5 μL,DNA 模板1 μL。反應條件為94 ℃ 3 min預變性,94 ℃ 45 s變性,60 ℃ 45 s退火,72 ℃ 72 s延伸,35個循環;72 ℃ 7 min后延伸。取10 L PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA片段長度,并在凝膠成像系統中觀察條帶大小,確認質量合格、無明顯雜帶后,將經過PCR擴增的產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序并拼接[5]。測得的序列結果在NCBI網站上的“Blast”GenBank數據庫比對,獲取與所測序列相似度高的序列,判斷16S rDNA基因鑒定結果。

1.4 系統進化樹的構建取得雙向測序拼接后的完整病原菌DNA序列后,導入NCBI網站上的“Blast”數據庫中進行比對,設置參數Identify>95,再下載Identify最高的前12條16S rDNA序列,并利用MEGA7.0版本軟件進行序列多重比對后,采用MEGA7.0-Phylogeny繪制Neighbor-Joining系統進化樹[7-8]。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學鑒定結果采集的598份鼻拭子樣本中,通過形態學鑒定的菌株共391株,分別為葡萄球菌屬211株、大腸埃希氏菌屬102株、芽孢桿菌屬76株、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌各1株。

2.2 病原菌分子學鑒定結果

2.2.1分離菌株16S rDNA擴增結果。對形態學鑒定未知的菌株,PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,擴增獲得的目標片段大小均約為1 500 bp,其中WJ61和HS100樣品菌株的電泳擴增結果見圖1。

注:M為DNA Marker,1為WJ61菌株,2為HS100菌株。Note:M is DNA Marker,1 is WJ61 strain,and 2 is HS100 strain.

2.2.2未知菌株系統進化樹構建與同源性比對。以WJ61菌株為例,獲得拼接過的完整細菌序列后,提交至NCBI“Blast”數據庫中,由MEGA7.0軟件制作系統進化樹。菌株WJ61的16S rDNA序列與紅沙雷氏菌JCM1240(登錄號為:NR-024644.1)、DSM4480(登錄號為:NR-114716.1)和NBRC103169(登錄號為:NR-114232.1)在同一側支上,同源性達100%,親緣關系最為接近。綜合其革蘭氏染色和測序結果,判定菌株WJ61為紅沙雷氏菌(圖2)。剩余10株未知菌株的16S rDNA序列比對結果見表1。

表1 未知菌株基因序列比對結果

圖2 WJ61菌株系統進化樹構建Fig.2 Phylogenetic tree construction of WJ61 strain

對未知菌株進行16S rDNA基因PCR擴增,再經測序比對以及革蘭氏染色,共鑒定出11種不同菌株(細菌革蘭氏染色圖見圖3),分別為鮑曼不動桿菌、糞腸球菌、紅沙雷氏菌、萊克勒西亞菌、銅綠假單孢菌、乳酸明串珠菌、奇異變形桿菌、普羅維登斯尼比亞菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、假單孢菌。

2.3 病原菌檢出結果采集的598份湖羊鼻拭子病原菌檢出結果見表2。由表2可知,598份鼻拭子樣本中共檢出445株菌株,分屬15個種屬,分別為葡萄球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、普羅維登西亞菌屬、萊克勒西亞菌屬和Lelliottia屬。檢出菌株數最多的為葡萄球菌屬,其次依次為腸桿菌屬和芽孢桿菌屬。葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、紅沙雷氏菌、乳酸明串珠菌、萊克勒西亞菌和銅綠假單孢菌均屬于條件致病菌。巴氏桿菌(1株)、鏈球菌(1株)、鮑曼不動桿菌(5株)屬于羊呼吸道致病菌。

表2 4個湖羊場呼吸道微生物分布

從區域分布情況看,霍山縣241份樣本中共檢出223株菌株(檢出率92.53%),分屬9種菌屬;望江縣華陽鎮180份樣本中共檢出74株菌株(檢出率41.11%),分屬6種菌屬;望江縣鴨灘鎮83份樣本中共檢出54株菌株(檢出率65.06%),分屬7種菌屬;宿松縣94份樣本中共檢出94株菌株(檢出率100%),分屬6種菌屬。其中,霍山縣樣本中呼吸道致病菌檢出率2.24%,宿松縣樣本中呼吸道致病菌檢出率2.13%,望江縣2個羊場的樣本中均未檢出上述呼吸道致病菌。

3 結論與討論

湖羊呼吸道疾病的發生通常是由多種細菌引起的。多殺性巴氏桿菌、溶血性鏈球菌、鮑曼不動桿菌以及曼氏小體等是引起湖羊呼吸道疾病發生的主要致病菌,且與湖羊呼吸道疾病的持續感染有關[9]。

該試驗按照90%的置信區間,從安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個湖羊養殖場共采集598份鼻拭子樣本,經細菌分離純化、鑒定,共檢出445株菌株,分屬15個種屬,分別為葡萄球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、普羅維登西亞菌屬、萊克勒西亞菌屬和Lelliottia屬。檢出菌株數最多的為葡萄球菌屬,其次依次為腸桿菌屬和芽孢桿菌屬。葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、紅沙雷氏菌、乳酸明串珠菌株、萊克勒西亞菌和銅綠假單孢菌均屬于條件致病菌。巴氏桿菌(1株)、鏈球菌(1株)、鮑曼不動桿菌(5株)屬于羊呼吸道致病菌。從區域分布看,霍山縣241份樣本中共檢出223株菌株(檢出率92.53%),分屬9種菌屬;望江縣華陽鎮180份樣本中共檢出74株菌株(檢出率41.11%),分屬6種菌屬;望江縣鴨灘鎮83份樣本中共檢出54株菌株(檢出率65.06%),分屬7種菌屬;宿松縣94份樣本中共檢出94株菌株(檢出率100%),分屬6種菌屬。其中,霍山縣樣本呼吸道致病菌檢出率最高(2.24%),其次為宿松縣(2.13%),望江縣2個羊場的樣本均未檢出上述呼吸道致病菌菌株。由此可見,雖然這4個羊場的樣本中呼吸道致病菌檢出率較低,但葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌和銅綠假單孢菌等條件致病菌均有較高的檢出率。條件致病菌雖不能直接導致呼吸道疾病的發生,但在外界環境改變或機體自身免疫力下降時,容易使得羊群產生其他疾病或感染,而在這個過程中就有可能誘發羊群呼吸道疾病的發生。

何川川[10]調查發現,新疆部分地區健康羊呼吸系統優勢菌種分別為糞腸球菌、乳酸乳桿菌、羊莫拉菌、溶血不動桿菌、鏈球菌和溶血性曼氏桿菌等。韓林梅[11]對廣西6個地區的73份樣品進行檢測發現,廣西部分地區主要以肺炎支原體、肺炎克雷伯氏菌和化膿隱秘桿菌等的感染為主。該試驗采集的598份樣本中,優勢菌株主要為葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等條件致病菌,霍山縣樣本中還檢出了鏈球菌、蒙氏腸球菌、銅綠假單孢菌、鮑曼不動桿菌、河生雷特勒氏菌和多殺性巴氏桿菌;望江縣樣本中檢出了乳酸明串珠菌、紅沙雷氏菌、普羅維登斯尼比亞菌和奇異變形菌;宿松縣樣本中檢出了鮑曼不動桿菌和萊克勒西亞屬。說明湖羊呼吸道病原微生物種類存在一定的地區性差異。

該研究結果表明,安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的湖羊呼吸道病原微生物中優勢菌株主要為葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等條件致病菌,巴氏桿菌、鏈球菌、鮑曼不動桿菌等致病菌檢出率較低。所以,了解該區域內的湖羊呼吸道病原微生物的種類和分布情況,對于合理選擇敏感藥物來進行科學防治具有指導意義。