枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊對肝臟儲備功能不同的肝硬化患者的腸道屏障功能與Th9 細胞表達的影響

張笑丹 梁平 梁倞 王洪博 蘇江衛(wèi)

河北省胸科醫(yī)院1藥學部，3醫(yī)學裝備處，4試驗部（石家莊 050041）；2河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院藥學部（石家莊 050011）

肝硬化是由一種或多種原因引起肝臟損害，也是各種肝病發(fā)展的晚期階段，常見病因包括藥物毒物、免疫紊亂、膽汁淤積、慢性酒精中毒、血吸蟲、病毒性肝病等［1-2］。肝硬化在臨床上主要表現(xiàn)為肝功能減退和門靜脈高壓，常出現(xiàn)多種并發(fā)癥［3］。現(xiàn)代研究表明細菌易位及腸道菌群失調可導致肝硬化并發(fā)癥，而腸道上皮屏障功能障礙是導致細菌易位的重要因素。目前，隨著腸-肝軸理論的建立，肝硬化患者的腸道屏障功能得到了廣泛重視與研究［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝硬化患者肝臟儲備功能下降，腸道的通透性增加，可誘發(fā)肝腹水的發(fā)生［5-6］。因此研究肝臟儲備功能不同的肝硬化患者的腸道屏障功能，對其治療具有重要意義。初始CD4+T 細胞在IL-4 和轉化生長因子β（TGF-β）聯(lián)合作用下可誘導分化為IL-9+IL-10+Foxp3-效應性T 細胞，即Th9 細胞，是當前新的CD4+效應性T 細胞［7-8］。微生態(tài)制劑（Probioties），是指運用微生態(tài)學原理，利用對宿主有益無害的益生菌或益生菌的促生長物質，經特殊工藝制成的制劑，其作用主要是調整微生態(tài)失調，保持生態(tài)平衡，提高人體的健康水平，以達到防病、治病的效果［9-10］。枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊也叫枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊，為典型的微生態(tài)制劑，能提高細胞活性，調節(jié)機體免疫，調控巨噬細胞，抑制血小板黏附［11-12］，但是對腸道屏障功能與Th9 細胞表達的影響還尚不清楚。因此，本文具體探討了枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊對肝臟儲備功能不同的肝硬化患者的腸道屏障功能與Th9 細胞表達的影響，希望為此類疾病的研究和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院2020年6月至2022年8月期間接受診療的肝硬化患者172 例作為研究對象，納入標準：18 ～65 歲；患者知情同意本研究；通過詢問病挑選史、臨床檢查、實驗室檢查、CT 檢查確診為肝硬化，符合“病毒性肝炎防治方案”中肝硬化的診斷標準；研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準（編號：2020030619）。排除標準：（1）近2 周使用抗生素、微生態(tài)制劑及影響腸道菌群制劑；（2）合并嚴重的內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病；（3）不能嚴格遵循醫(yī)囑導致治療無效者；合并肝癌患者；（4）精神疾病患者；（5）妊娠與哺乳期婦女。根據(jù)肝臟儲備功能不同分為Child-Pugh A 級（觀察組）72 例與Child-Pugh B-C 級（對照組）100 例，對比兩組患者的合并疾病、體重指數(shù)、性別、年齡、病程等資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料對比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

表1 兩組一般資料對比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

組別觀察組對照組χ2/t 值P 值合并疾病（糖尿病/高血壓/高脂血癥）（例）例數(shù)72 100性別（男/女，例）38/34 55/45 0.223＞0.05年齡（歲）58.22 ± 2.48 58.02 ± 3.10 0.193＞0.05體質指數(shù)（kg/m2）22.93 ± 2.14 23.33 ± 1.04 0.332＞0.05病程（年）5.20 ± 1.44 5.09 ± 1.33 0.183＞0.05 13/12/10 18/16/15 0.241＞0.05

1.2 治療方法 所有患者都在常規(guī)治療手段的基礎上加用腸道益生菌制劑治療，口服枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊（枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊，北京韓美藥品有限公司制造），500 mg/次，3 次/d。常規(guī)治療包括保肝、利尿、降低門脈壓力、退黃等處理。所有患者治療觀察14 d。

1.3 觀察指標 （1）療效標準：顯效：天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢查正常，臨床癥狀與體征改善明顯。有效：ALT 與AST比正常值上限小2 倍，臨床癥狀與體征顯著減輕；無效：惡化或未達到上述標準。（有效+顯效）/本組例數(shù)×100%=總有效率。（2）檢測腸道屏障功能：在治療前后留取足量糞便標本，放置于-70 ℃冰箱內保存，收齊標本后統(tǒng)一檢測腸桿菌、乳酸桿菌、白色念珠菌、腸球菌、雙歧桿菌等菌屬的含量，以百分比進行表述。（3）炎癥因子變化對比：在治療前后抽取空腹時靜脈血3 mL，1 000 r/min共離心5 min，選擇上清血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測炎癥因子［（白介素-6（IL-6）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］的表達。（4）Th9 細胞檢測：采用流式細胞儀檢測外周血Th9 細胞含量，每個樣品設置三個復孔，取檢測的平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.00 進行統(tǒng)計分析，用±s表示計量資料，對比方法為χ2檢驗和t檢驗等，性別等計數(shù)資料采用百分比表示，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對比兩組總有效率 對比觀察組與對照組治療后的總有效率分別為98.6%和89.0%，觀察組優(yōu)于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 對比兩組總有效率Tab.2 Compare the total effective rate of two groups 例

2.2 腸道菌群變化對比 兩組治療前腸道菌屬比較無明顯差異（P＞0.05）；觀察組治療后雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬較治療前有顯著增加（P＜0.05），白色念珠菌屬較治療前有明顯的降低（P＜0.05），對比治療前后對照組腸道菌群差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后腸道菌群變化對比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

表3 兩組治療前后腸道菌群變化對比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

注：與治療前對比，*P ＜0.05；與對照組對比，#P ＜0.05

菌群腸桿菌屬腸球菌屬雙歧桿菌屬乳酸桿菌屬白色念珠菌屬觀察組（n = 72）治療前15.67 ± 2.42 18.23 ± 3.02 24.02 ± 3.11 20.34 ± 2.44 20.00 ± 2.94治療后16.29 ± 2.11 18.33 ± 3.92 27.99 ± 3.93*#23.87 ± 3.02*#18.39 ± 3.90*#對照組（n = 100）治療前15.89 ± 2.22 17.90 ± 3.20 24.67 ± 3.10 20.54 ± 3.14 20.34 ± 2.84治療后16.09 ± 2.11 18.33 ± 2.94 25.55 ± 3.39 21.98 ± 3.11 21.88 ± 4.11

2.3 炎癥因子變化對比 對比兩組治療后血清TNF-α 與IL-6 值，觀察組與對照組均低于治療前（P＜0.05），且治療后觀察組低于對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 對比兩組患者治療前后的血清炎癥因子變化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

表4 對比兩組患者治療前后的血清炎癥因子變化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

注：與治療前對比，*P ＜0.05；與對照組對比，#P ＜0.05

菌群IL-6 TNF-α觀察組（n = 72）治療前288.36 ± 14.98 289.65 ± 20.37治療后95.67 ± 18.54*#120.97 ± 22.34*#對照組（n = 100）治療前8.64 ± 1.55 8.66 ± 1.34治療后2.65 ± 0.98*5.01 ± 0.98*

2.4 Th9 細胞變化對比 治療后觀察組與對照組的Th9 細胞分別為（0.11±0.05）%和（0.32±0.10）%（P＜0.05），均低于治療前的（0.82 ± 0.32）%和（0.83 ± 0.24）%，觀察組Th9 細胞治療后低于對照組（P＜0.05）。見表5。

表5 對比兩組患者治療前后Th9 細胞變化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

表5 對比兩組患者治療前后Th9 細胞變化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

組別觀察組對照組t 值P 值例數(shù)72 100治療前0.82 ± 0.32 0.83 ± 0.24 0.045＞0.05治療后0.11 ± 0.05 0.32 ± 0.10 7.298＜0.05 t 值33.294 25.682 P 值＜0.05＜0.05

3 討論

目前，肝硬化發(fā)病率依然較高，發(fā)病高峰年齡在35 ～48 歲［13］。肝硬化早期無明顯臨床表現(xiàn)，隨著病情的發(fā)展，肝功能逐漸減退，可誘發(fā)肝功能衰竭。現(xiàn)代醫(yī)學認為肝硬化可逆轉，但缺乏理想的針對性治療藥物，且停藥后常會復發(fā)。肝臟儲備功能是反映肝功能狀態(tài)的主要指標，一般采用Child-pugh 分級進行判定，Child-pugh 分級越高，肝臟儲備功能越差［14-15］。當前研究表明肝硬化患者可出現(xiàn)腸道屏障功能障礙，由此產生的腸道細菌紊亂是引起肝硬化進一步惡化和促進肝性腦病發(fā)生的重要因素［16］。腸道是機體最大的內毒素池，內毒素可通過腸粘膜屏障經門靜脈進入肝臟，肝硬化患者中血清中可以檢測到內毒素水平變化［17］。內毒素是革蘭氏陰性菌的主要重要組成，在患者腸道屏障被破壞、腸道通透性增加時，可以被釋放入血液。有研究表明肝硬化腸道菌群失調，主要表現(xiàn)為白色念珠菌等的增加，有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌的減少［18］。微生態(tài)制劑不僅可以糾正腸道菌群紊亂而且能抑制腸道細菌發(fā)生易位，對腸黏膜屏障功能起到恢復和保護作用。枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊對調節(jié)人體腸道菌群失調有顯著功效，其含有枯草桿菌和屎腸球菌兩種活菌，對致病菌的生長有一定的抑制作用，但對腸道內有益菌的生長有促進作用［19］。本研究顯示治療后觀察組與對照組的總有效率分別為98.6%和89.0%，觀察組優(yōu)于對照組。且觀察組治療后雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬較治療前有顯著增加，白色念珠菌屬較治療前有明顯的降低，而對照組治療前后腸道菌群比較無明顯差異。從機制上分析，枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊本身的雙歧桿菌可平衡腸道菌群種類和數(shù)量的改變，同時枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊本身可以促進腸道有益菌的生長，也可以直接分泌代謝物質提高腸道免疫功能［20］。也有研究發(fā)現(xiàn)枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊可有效治療肝硬化合并自發(fā)性腹膜炎，顯改善肝硬化患者肝功能，對腸道菌群生長的微環(huán)境有明顯改善，對腸道菌群失調起到調節(jié)作用［21］。同時枯草桿菌能利用自身產生的多種消化酶分解纖維蛋白、脂肪等物質，促進消化吸收，從而抑制腸道內有害細菌過度繁殖，調整腸道菌群［22］。

腸道微生物衍生的化合物及其影響的信號通路與肝硬化的進展有關。而TNF-α 是判斷腸道屏蔽功能的重要指標，可破壞腸上皮細胞的屏蔽功能，增加腸黏膜的通透性，另外TNF-α 也可加重肝細胞的損傷和形成內毒素血癥，從而促進其他炎性因子和氧自由基的大量釋放［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道神經細胞可通過分泌的IL6 起到抑制調節(jié)性T 細胞水平的作用，在神經細胞特異性缺失IL6 的腸道中，調節(jié)性T 細胞水平有所上升。另外，調節(jié)性細胞誘導菌很有可能是通過降低腸道神經系統(tǒng)密度和神經細胞IL6 水平的雙重作用，來誘導調節(jié)性T 細胞的［25］。本研究顯示對比兩組治療后血清TNF-α 與IL-6 值，觀察組與對照組均低于治療前，且治療后觀察組低于對照組。提示枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊可降低肝硬化患者IL-6 與TNF-α 的水平，來改善肝臟炎癥和腸道屏蔽功能。也有研究［26］表明微生態(tài)制劑對非產氨乳酸桿菌數(shù)量的增加有顯著促進作用，有效降低患者內毒素血癥及血氨，50%患者的Child-Pugh 評分得到改善，這與本研究結果具有一致性。

Th9 細胞是一種新型CD4+輔助性T 細胞亞群，主要分泌IL-9，在炎癥性腸病等自身免疫性疾病發(fā)揮重要作用，IL-9 通過與IL-9R 結合激活信號轉導依賴性JAK-STAT 途徑發(fā)揮生物學功能［27］。不過在不同的微環(huán)境中，Th9 細胞發(fā)揮不同的免疫調節(jié)功能，研究［28］發(fā)現(xiàn)乙肝肝硬化患者中Th9 細胞顯著升高，同時也表現(xiàn)為腸道屏障功能紊亂，兩者相互促進并參與乙肝肝硬化的發(fā)生與發(fā)展。本研究顯示治療后觀察組與對照組的Th9 細胞都低于治療前，觀察組治療后Th9 細胞低于對照組，表明枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊在治療肝臟儲備功能良好的肝硬化患者中能減少Th9 細胞，將為明確肝硬化的發(fā)病機制及治療提供新的理論和線索。

總之，相對于肝臟儲備功能差的患者，枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊在肝臟儲備功能良好的肝硬化患者中的應用能改善腸道屏障功能，抑制Th9細胞表達，抑制炎癥因子的表達，從而更好的發(fā)揮治療效果。

【Author contributions】ZHENG Xiaodan performed the experiments and wrote the article.WANG Hongbo performed the experiments.LIANG Ping and LIANG Jing revised the article.SU Hongwei designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.