RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 在小兒腎母細胞瘤組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

徐莉 陳運旺 廖趙妹 林強 陳乙云

海南醫學院第二附屬醫院兒科一區（海口 570311）

腎母細胞瘤在臨床上是較常見的兒童實體性腫瘤病癥之一，患病率在小兒全部腫瘤疾病中占9%，且有較高的病死率，嚴重影響患兒的生命安全［1-3］。臨床主要選用化療或放療等方案治療小兒腎母細胞瘤。因腎母細胞瘤的生物機制較多變，且目前腎母細胞瘤病理機制尚未清晰，因此找尋具有特異性的腫瘤標志物極為重要［4］。學者在胃癌、肺癌、神經母細胞瘤、乳腺癌等多類的實體腫瘤內監測出RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 呈現異常表達，而TOPOⅡα、CXCR4 以及RGS4 蛋白在小兒腎母細胞瘤產生、進展中的意義報道較少［5-6］。基于此，本研究分析了經測定RGS4 蛋白、CXCR4 及TOPOⅡα 在小兒腎母細胞瘤組織中的表達，探究在小兒腎母細胞瘤中上述指標的病理特征及與預后生存的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2020 年1 月于海南醫學院第二附屬醫院進行手術治療的腎母細胞瘤40 例患兒為研究對象，并在術后留取距離癌組織邊緣＞4 cm 的癌旁組織40 例作對照。臨床資料具有可比性（P＞0.05），且此次研究均在患兒家屬同意下完成。研究經我院倫理委員會批準［批準號：（2016）倫審第（42）號］。

預后效果判斷標準：（1）預后良好，腎母細胞瘤＜5 cm，5 年生存率≥84%；（2）預后不良，腎母細胞瘤≥5 cm，且伴有其他先天性發育不良。

納入標準：所有小兒腎母細胞瘤均符合《兒童腎母細胞瘤診療專家共識》［7］中的相關診斷要求；均經影像學、病理特征、實驗室指標等明確病癥；術前未接受放療、化療等診治的患兒。

排除標準：存在心肺功能異常、慢性感染性病癥、惡性腫瘤等病癥的患兒；伴有精神類病癥和心理病癥的患兒。

1.2 免疫組織化學法檢測RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達 采用免疫組化法對RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 進行檢測，步驟如下：脫蠟，脫蠟前在室溫中將組織放約2 h，或60 ℃恒溫下烘烤10 ～15 min，后用二甲苯浸泡、沖洗。用5% 甲醇培養15 min，加緩沖液內直到煮沸，自然冷卻至室溫。抗原修復，加封閉血清液，室溫放30 min，清除多余血清，加二氨基聯苯胺（DAB）試劑，37 ℃培養箱中孵育40 min。加顯色劑，光鏡下顯色，光鏡下觀察免疫組化染色情況。

按染色狀況及細胞高表達的百分比分析CXCR4、RGS4 蛋白、TOPOⅡα 表達水平：（1）無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；（2）未出現高表達細胞為0 分，細胞高表達比例＜10%為1 分，比例處于10% ～15%為2 分，比例＞50%為3分。總評分：上述兩項得分相乘，≤3 分為低表達，≥4 分為高表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析處理。應用Kolmogorov-Smirnov 檢驗數據是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier 法繪制腎母細胞瘤患兒生存曲線，生存比較采用Log-rank 檢驗，應用多元線性逐步回歸分析影響小兒腎母細胞瘤預后的危險因素，檢驗水準α= 0.05，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 在腎母細胞瘤組織、癌旁組織的表達 如表1、圖1 所示，相較于癌旁組織，腎母細胞瘤組織中TOPOⅡα、CXCR4的高表達率升高，RGS4 蛋白高表達率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 在腎母細胞瘤組織、癌旁組織的表達Tab.1 Expression of RGS4 protein，CXCR4，and TOPOⅡα in nephroblastoma tissue and paracancerous tissue 例（%）

2.2 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達與腎母細胞瘤患兒臨床病理特征的關系分析 如表2 所示，RGS4 蛋白與淋巴結轉移、病理種類、復發轉移、TNM 分期呈負相關；CXCR4、TOPOⅡα 與病理種類、淋巴結轉移、TNM 分期、復發轉移呈正相關（P＜0.05）。

表2 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達與腎母細胞瘤患兒臨床病理特征的關系分析Tab.2 Relationship between expression of RGS4 protein，CXCR4，TOPOⅡα and clinicopathologic features in pediatric wilms tumor例（%）

2.3 腎母細胞瘤患兒3年生存率 隨訪3年，有2例失訪，38 例腎母細胞瘤患兒3 年的總生存率為68.42%（26/38）。RGS4 蛋白高表達者總生存率較高，CXCR4、TOPOⅡα 高表達的患兒總生存率較低（圖2）。

圖2 小兒腎母細胞瘤的生存曲線Fig.2 Survival curve of pediatric wilms' tumor

3 討論

腎母細胞瘤屬于小兒腎癌內較常見的一類疾病，據研究表明，在小兒惡性腎腫瘤中腎母細胞瘤的患病率約占6%［8-9］。惡性腫瘤疾病的產生、浸潤轉移及發展是由各種轉錄因子、趨化因子及介導信號等途徑實現，因而找尋診斷腎母細胞瘤的產生、發展有關的腫瘤標志物為目前的研究熱點［10-11］。

RGS 屬于GTP 酶激活蛋白的一種，能促進GTP 的水解，且RGS 可對轉導G 蛋白信號進行負性調控，以對G 蛋白信號的介導水平調節及平衡不同的G 蛋白信號傳導通路之間的關系，可在介導信號通路的偶聯能力調節過程中參與［12-13］。本研究發現，癌旁組織中RGS4 蛋白的高表達率明顯高于腎母細胞瘤組織，且RGS4 蛋白高表達率可與臨床病理特征相關，與其他學者研究較相似［14-15］。RGS4 蛋白與多種類型的腫瘤疾病的發生、發展有緊密聯系，且RGS4 可經失活的G 蛋白抑制G 蛋白的受體偶聯傳導信號通路，進而抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移，故而推測RGS4 蛋白在腎母細胞瘤內屬于抑癌因子［16］。表明RGS4 蛋白表達可能在腎母細胞瘤的產生、轉移及發展期間發揮重要意義。

CXCR4 屬于CXCL12 中主要的受體之一，CXCL12 還能與CXCR4 的N 端結合，在腫瘤對免疫反應介導、侵潤侵襲轉移、腫瘤血管新生提高等病理過程中發揮重要的作用。有國外研究［17］發現，在腎癌、乳癌及前列腺癌等疾病產生中CXCR4 異常表達發揮了關鍵作用。TOPOⅡα 可有效傳導DNA的斷裂且生成新的DNA-蛋白酶的復合物，在DNA的轉錄、復制及翻譯中均與參與。腫瘤細胞增殖的調控中，其編碼的TOPOⅡα 屬于ATP 依賴的對于細胞發揮重要作用的合成酶及水解酶。作用于染色體濃縮維持、分離染色體等主要的生理過程，且在增殖活性異常提升的腫瘤細胞內TOPOⅡα 水平明顯上升［18］。本研究顯示，CXCR4 高表達是影響腎母細胞瘤患兒預后生存的主要風險因素。相較于癌旁組織中CXCR4 表達，在腎母細胞瘤組織中CXCR4、TOPOⅡα 表達較高，還與淋巴結轉移、TNM 分期、臨床病理特征等相關，與其他學者研究結果較為一致［19-20］。表明CXCR4 在患兒生存預后評估中有著重要的作用。

綜上所述，通過檢測腎母細胞瘤組織中的RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達變化，可發現RGS4 蛋白、TOPOⅡα、CXCR4 與TNM 分期、復發轉移、病理類型、淋巴結轉移及預后療效有緊密的關聯。

【Author contributions】XU Li performed the experiments and wrote the article.CHEN Yunwang，LIAO Zhaomei，LIN Qiang and CHEN Yiyun performed the experiments.All authors read and approved the final manuscript as submitted.