水中大環內酯類、磺胺類和喹諾酮類抗生素前處理分析方法優化★

楊 栩，陳弘麗

（廣東省中山生態環境監測站，廣東 中山 528400）

抗生素是一類由微生物或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的即次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質[1]。作為一種消炎藥物被廣泛應用于各種病痛的治療當中，但是抗生素被濫用的危害也是顯而易見的。近20 年來，中國的湖泊被報道檢測出有39 種抗生素，其主要類型為磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環類脂類以及β-內酰胺類等[2]。其中，單一磺胺類抗生素的質量濃度最高達940 ng/L，是檢出濃度最高的種類之一，而單一喹諾酮類抗生素濃度最高可達713 ng/L[2]。正是因為對環境持續輸入，抗生素對生態環境帶來危害，同時通過物質與能量循環，對人體健康產生影響。因此，提升抗生素的檢測分析技術有助于在“環境-生物-人類”系統中了解抗生素在各要素間的相互聯系和作用，對環境中抗生素的痕量分析、溯源追蹤和循環流動，為后續抗生素的處理和有效使用有著積極的指導意義。

1 抗生素前處理分析研究發展現狀

我國目前還沒有建立適用于水中多組分抗生素的檢測標準，根據已有的檢測技術大部分暫時不能實現多種類型抗生素的同時檢測，導致檢測耗時較長、操作過程繁瑣[3]。經過多年的技術發展，UPLC-MS/MS技術可對復雜的樣品進行快速分析，準確定性、定量目標化合物，顯著提高信噪比和靈敏度[4]，目前已經成為抗生素檢測與研究最常用的分析儀器技術。根據大量研究抗生素分析的文獻顯示，固相萃取法作為抗生素分析的預處理方法最為普遍[5]。然而較少文獻對預處理方法優化進行深入研究，部分已有研究成果在適用種類或目標物數量方面具有局限性，主要集中在過濾條件、淋洗液種類及比例用量和干燥時長[6]這幾個因素，鮮有文獻在不同pH 值的水樣條件下探討不同種類抗生素的預處理效果，而縱觀多數文獻對各自地方河流或其他載體進行抗生素污染空間分布特征和環境風險評估等研究時，采用的都是酸性條件下的水樣，但并沒有在其他條件下和種類數量上進行更深入的探討，而且同類抗生素中回收率高的目標物數量并不多[7]。

本文主要考慮在5 種不同pH 值和添加不同濃度EDTA 的水樣條件下，對大環內酯類抗生素、磺胺類抗生素和喹諾酮類抗生素部分目標物回收率的影響。

2 實驗部分

2.1 主要儀器和試劑耗材

主要儀器：液相色譜-三重四級桿質譜儀，LC-30AD Triple Quad 4500；色譜柱，島津XRD-ODS，100 mm×2.0 mm；全自動固相萃取儀，GL Sciences 799；氮吹濃縮儀，TurboVapⅡ；棕色采樣瓶（2 500 mL，棕色磨口硬質玻璃瓶）；其他一些實驗室常用儀器和設備。

主要試劑、耗材：甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；鹽酸，分析純；氨水，分析純；EDTA，分析純；無水硫酸鈉，分析純；標準溶液、固相萃取柱（HLB，200 mg，6 mL）和濾膜（0.22 μm）。

2.2 高效液相色譜儀器條件（表1）

流動相A：水相（0.1%甲酸）；流動相B：乙腈（0.1%甲酸）；洗針液：甲醇喝水（1∶1）混合。梯度洗脫程序見表1：流速0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣體積，10 μL。

2.3 水樣預處理條件（固相萃取條件）

分別取5 組共10 個1 000 mL 水樣，分別加入10 μg 標準物質，通過氨水或鹽酸分別按照pH 值為2、4、7、9 和12 的范圍調節水樣的酸堿性，及同一pH值條件加入不同量的EDTA 進行研究。HLB 固相萃取柱安裝在全自動固相萃取儀上，設置參數10 mL 甲醇5 mL/min 流速活化。將上述水樣以15 mL/min 的流速上樣，抽干固相萃取柱，加入10 mL 純水淋洗兩次，最后吹干柱子。用2 mL 甲醇3 mL/min 的流速洗脫。收集洗脫溶液后，再通過無水硫酸鈉脫水，在氮吹濃縮儀上濃縮至1 mL，水浴溫度為40 ℃，氮吹流量調至液面輕微晃動，用0.22 μm 濾膜過濾，待測。每一個同等條件的水樣全程序重復測定6 次，計算每種條件下的平均回收率。

2.4 曲線的建立

移取適量的抗生素混合標準溶液，配制至少7 個濃度點的標準系列，各組分質量濃度分別為2.50、6.25、12.5、25.0、62.5、100、125 μg/L。按照儀器條件，由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進行測定，以標準系列溶液中的目標組分的質量濃度（μg/L）為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，建立標準曲線。

3 結果與討論

化合物在不同條件下的平均回收率見表2。由表2可知，pH 值對這三類抗生素的形態和作用有顯著性影響，而EDTA 的添加對各化合物的影響有特別顯著的規律性。大環內酯類抗生素有8 種化合物在pH=4條件下加標回收率在80.0%～112%；磺胺類抗生素在pH=4 條件下均有良好的回收率（80.9%～107%）；喹諾酮類抗生素在pH=12 條件下有著良好的回收率（84.4%～112%），三類抗生素添加EDTA的回收率更佳。

表2 各化合物在不同條件下的平均回收率 %

4 結論

在5 種不同pH 值和是否添加EDTA 試劑的水樣條件下，對8 種大環內酯類抗生素、16 種磺胺類抗生素和9 種喹諾酮類抗生素采用固相萃取-HPLC 法進行加標回收率的數據統計和分析，大環內酯類抗生素和磺胺類抗生素在酸性（pH=4）條件下可以獲得較好的回收率，喹諾酮類抗生素在堿性（pH=12）條件下可以獲得較好的回收率，而對于三類抗生素物質，EDTA 的添加對目標物回收率更佳。對不同種類的抗生素目標物進行前處理技術的探索和優化有助于促進抗生素檢測分析技術的發展，有效提高水中抗生素分析的準確性，同時抗生素檢測分析方法可以應用于區域水域的抗生素生態毒性和健康風險評估，對于未來更好建立和完善水系抗生素檢測分析技術方法和標準具有積極的意義。