不同誘孢方法對辣椒疫霉菌孢子囊消長動態的影響

趙巖 祝文慧 趙曉軍 殷輝 任璐 周建波

關鍵詞：辣椒疫霉菌；最佳誘孢條件；抹傷處理；孢子囊產生；孢子囊釋放

辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsicaLeonian）侵染辣椒植株引起的辣椒疫病是世界范圍內普遍發生的一種毀滅性土傳病害，是辣椒三大主要病害之一。該病害在辣椒整個生育期均會發生，在成株期危害最大[1]。該病害潛伏期短，蔓延速度快，傳播范圍廣，常造成辣椒嚴重減產，甚至絕收[2-4]。辣椒疫病防治一直是辣椒生產的關鍵問題和難點問題[5]。辣椒疫霉菌屬于霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫霉屬（Phytophthora）[6-7]。無性階段孢子囊是辣椒疫病田間再侵染的重要來源[8-9]，也是該病害相關研究的主要病原接種體[10]。獲得足量辣椒疫霉菌孢子囊，能夠為辣椒疫霉菌生物學特性、遺傳分析及致病性等研究提供根本保證[11-12]。辣椒疫霉菌產生孢子囊的條件較為苛刻，在常規培養條件下不產生孢子囊或產孢子囊量較少[13]。目前，已有大量關于辣椒疫霉菌、致病疫霉菌等卵菌致病菌誘導孢子囊產生的培養環境條件、培養基篩選和培養菌體處理方法等方面的相關報道[14-17]，研究主要關注了不同誘孢方法對靶標菌最大產孢量的影響，但是不同誘孢方法對孢子囊消長動態影響的相關報道較少。

本研究將優化培養基和簡化誘孢操作相結合，研究不同誘孢條件下辣椒疫霉菌孢子囊產生和釋放變化動態，旨在明確其對辣椒疫霉菌孢子囊產生和釋放的影響，為辣椒疫病的相關研究提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 辣椒疫霉菌BY1（Phytophthoracapsica），由山西農業大學植物保護學院植物病害研究室分離、純化、鑒定和保存。

1.1.2 供試培養基 PDA培養基（土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），OA培養基（燕麥30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），CA培養基（胡蘿卜200g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），V8培養基（V8汁100mL、碳酸鈣0.02g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），均在121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min[18]。

辣椒組織培養基（簡稱PA培養基）的配置方法為：取方椒果肉榨汁，過濾稱取方椒汁200g，加入瓊脂20g，用蒸餾水定容至1000mL，并將pH值調至7.0，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養基對BY1菌落生長的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅接種于供試培養基平板中央，置于25℃恒溫培養箱培養，用十字交叉法測量菌落的最大擴展直徑[19-20]。每個處理3次重復。

生長速度［20-21］=（菌落直徑-5）/培養時間（1） 1.2.2 不同培養基對BY1產生和釋放孢子囊的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅分別接種于5種供試培養基平板中央，每種培養基接種60個皿，置于25℃恒溫培養箱培養，待其菌落長滿培養皿時，每間隔2d對3個培養皿進行一次鏡檢觀察，并記錄孢子囊總數和已完全釋放了游動孢子的空孢子囊數目。每個處理3次重復。

孢子囊計數方法為：向培養皿中加入10mL無菌水，用消毒滅菌的毛刷刷洗菌絲表面，將孢子囊菌懸液傾倒至體積為10mL的試管內，搖勻吸取10μL孢子囊菌懸液于顯微鏡10倍視野下觀察，統計孢子囊數量，然后根據孢子囊菌懸液的體積計算每毫升含有的孢子囊個數[22]。

1.2.3 抹傷處理對BY1產生和釋放孢子囊的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅分別接種于5種供試培養基平板中央，每種培養基接種60個皿，置于25℃恒溫培養箱培養，待其菌落長滿培養皿時，用滅菌涂布器進行菌絲抹傷處理，使所有菌絲貼于培養基平板上，繼續置于25℃恒溫培養箱內培養，每間隔2d對3個培養皿進行一次鏡檢觀察，并記錄孢子囊總數和已完全釋放了游動孢子的空孢子囊數目，孢子囊計數方法同1.2.2。以相同培養基上未抹傷處理作為對照，每個處理3次重復。

1.3 數據分析

利用MicrosoftExcel2010進行試驗數據平均值和標準差分析并繪制圖表；利用SPSS26.0軟件，采用Duncan′s新復極差法進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對BY1菌落生長的影響

如圖1所示，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養基上生長速度有所差異，在OA培養基上生長最快，滿皿時間為6d；在CA和PA培養基上生長速度次之，滿皿時間為7d；在PDA培養基上滿皿時間為8d；在V8培養基上生長最慢，滿皿時間為9d。辣椒疫霉菌BY1在各供試培養基上生長速度均呈現先升高后降低的變化趨勢（圖2）。

2.2 不同培養基對BY1產生和釋放孢子囊的影響

辣椒疫霉菌BY1在不同培養基上產孢子囊量的變化曲線如圖3所示。

由圖3可知，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養基上孢子囊的產生時間、最大產孢量及續存期和孢子囊的釋放時間均有所差異。待辣椒疫霉菌BY1在各供試培養基上長滿皿后，在PA培養基上6d就可以觀察到有孢子囊的產生，18d孢子囊量達到最大值，最大產孢續存期為8d；第26天孢子囊開始釋放游動孢子；在第34天孢子囊完全釋放，視野內全部為孢子囊空殼。在CA培養基上12d開始產生孢子囊，26d達到最大值，最大產孢續存期為6d；第32天孢子囊開始釋放游動孢子；第38天完全釋放。在V8培養基上18d開始產生孢子囊；第28天孢子囊產生量趨于穩定，最大產孢續存期為8d；第36天孢子囊開始釋放游動孢子；第44天完全釋放。在PDA和OA培養基上未觀察到孢子囊的產生。

由圖4可知，在5種供試培養基上，辣椒疫霉菌BY1在PA培養基上的最大產孢量顯著高于其他培養基（P<0.05），最大產孢量為7.238萬個/mL；CA培養基次之，最大產孢量為3.712萬個/mL；V8培養基最大產孢量為0.523萬個/mL。

2.3 抹傷處理對BY1產生和釋放孢子囊的影響

從圖5可以看出，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養基上經過抹傷處理后，孢子囊的產生時間、最大產孢量及其續存期和孢子囊的釋放時間均發生顯著變化。在PA培養基上，抹傷處理后比未處理的培養基孢子囊產生時間提前了2d，最大產孢續存期增加了2d，孢子囊的釋放時間增加4d；在CA培養基上，抹傷處理后培養基上的孢子囊產生時間提前了2d，最大產孢續存期增加了2d，孢子囊釋放期延長了2d；在V8培養基上，抹傷處理后培養基的產孢時間比未處理時提前了4d，但是最大產孢續存期不變，孢子囊釋放期縮短了2d；原本不產生孢子囊的OA培養基，抹傷處理后，在第24天觀察到孢子囊的產生，第28天達到最大產孢量且續存期為4d，第34天孢子囊開始釋放游動孢子，第40天孢子囊完全釋放，視野內全部為孢子囊空殼；在PDA培養基上仍未觀察到孢子囊的產生。

從圖6可以看出，在5種供試培養基上，長滿皿經過抹傷處理后，辣椒疫霉菌BY1在PA、CA和V8等3種培養基上的孢子囊產量顯著高于對照（P<0.05）。其中，PA培養基抹傷處理后產生的孢子囊量顯著高于其他誘孢處理（P<0.05），最大孢子囊產量為8.412萬個/mL；在OA培養基上經過抹傷處理也開始產生孢子囊，但最大孢子囊產量僅有0.299萬個/mL；PDA培養基上仍未產生孢子囊。

3 結論與討論

本試驗主要研究了不同培養基及抹傷處理對辣椒疫霉菌BY1孢子囊的產生和釋放的影響，并將整個過程劃分為菌落生長期（接種到菌落滿皿）、孢子囊產生前期（菌落滿皿到孢子囊開始產生）、孢子囊產生期（孢子囊開始產生到產孢量達到最大）、最大產孢續存期（保持最大產孢量的時期）、孢子囊釋放期（孢子囊開始釋放到完全釋放）5個階段。通過對各階段動態變化過程的研究，可詳細探究孢子囊發育周期及其影響因素，不再局限于用某一時間段或某一時刻的孢子囊數來衡量不同誘孢方法的產孢能力，如張榮等[23]將辣椒疫霉菌接種于5種培養基上，先置于26℃下暗培養3d，再連續光照培養6d后，隨機取3點于10倍視野下鏡檢發現，在PSA和大豆瓊脂培養基上產生的孢子囊較多，分別為13.88、13.77個/視野；許亞池等[24]通過不同配比V8培養基、不同黑暗培養時間及無菌水處理，培養10d后于10倍顯微鏡下觀察，探究對辣椒疫霉菌的產孢影響，結果發現，在5%V8培養基上，黑暗處理5d后加入適量無菌水，孢子囊最大產量為140個/視野。研究結果為以孢子囊為接菌體的相關試驗提供了技術支撐，也為辣椒疫霉菌的生物學特性、遺傳分析及致病性等與孢子囊相關的研究提供了理論支撐。

辣椒疫霉菌BY1在OA培養基上生長最快，接種后6d可滿皿，但未觀察到孢子囊產生，抹傷處理后滿皿24d開始產孢，但產孢量較小；在PA培養基上接種后7d滿皿，滿皿后6d開始產孢，產孢量在5種供試培養基中最高。說明辣椒疫霉菌是否產生孢子囊、產孢開始時間及產孢量與菌落生長期長短無關，主要取決于孢子囊產生前期的長短，即菌絲體產生孢囊梗后再產生孢子囊的快慢。PA培養基大幅縮短了辣椒疫霉菌孢子囊產生前期的時間，促進了菌體產生孢子囊，提高了產孢能力。抹傷處理縮短了孢子囊產生前期和孢子產生期的時間，促進疫霉菌提前進入最大產孢階段，同時也延長了最大產孢延續期和孢子釋放期的時間。

陳方新等[25]研制了幾種誘導苧麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSawada）產生游動孢子囊的蔬菜汁混合培養液，其中，番茄與黃瓜按體積比1∶2的配比得到的培養液誘孢效果最佳，最大產孢量為0.314萬個/mL；王拱辰等[26]從30種植物組織培養基中篩選出了3種能夠促進鐮孢屬（Fusarium）李瑟組產生大孢子、小孢子和產孢細胞。這些研究證明了植物組織或植物組織培養基可誘導病原菌無性孢子產生。蘭成忠等[27]通過果實創傷接種法將辣椒疫霉菌接種于黃瓜果實上，于28℃、24h光照培養4d后，黃瓜接種部位病斑迅速擴展，表面長出大量氣生菌絲并產生大量的孢子囊，其產孢量為1.35萬個/cm2，為辣椒疫霉菌寄主植物的植物體或組織培養液可以誘導孢子產生提供了理論依據。所以，本試驗選取了辣椒組織培養基（PA）誘導辣椒疫霉菌孢子囊的產生，研究發現，PA培養基結合抹傷處理在接菌后11d開始產孢，21d達到最大產孢期，最大產孢持續期10d，最大產孢量可達8.412萬個/mL，孢子囊釋放期為12d，誘導孢子囊產生和延緩孢子囊釋放作用均高于其他處理，且相比水淹法[23]等疫霉菌誘孢方法操作簡單，可用于辣椒疫霉菌孢子囊的誘集。