自擬調氣湯灌胃對順鉑誘導大鼠腎損傷的修復作用及其機制

阿依古麗·買合木提，古扎力努爾·艾爾肯，加依娜提·熱馬贊

1 新疆醫科大第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830054；2 新疆醫科大學中心實驗室

順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，在肺癌及胃癌等消化道腫瘤的治療中廣泛應用，但因有腎毒性臨床應用受到限制［1］。由順鉑引起的腎毒性通常表現出少尿、蛋白尿及腎小球濾過率降低等主要臨床特征，嚴重影響患者生存質量。以往臨床中對于順鉑引起的腎損傷主要采用甘露醇、氨磷汀等藥物治療，但存在有效率低，患者依從性差，同時易引起電解質紊亂等不良反應，因此對于順鉑誘導的腎損傷治療藥物的研發已成為當前工作重點。調氣湯是本課題組以中醫理論為指導自擬的一種中藥方劑，由黨參、白術、大黃等藥材組成，具有健脾益氣、燥濕利水、活血行氣的功效。2022年6—12月，我們觀察了自擬調氣湯對順鉑誘導大鼠腎損傷的修復作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠90 只，雄性，健康清潔級，8 周齡，體質量（200 ± 20）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（新）2018-0002。大鼠飼養于動物房，光照12 h/d，自由飲食，溫度22～25 ℃，濕度40%～70%。

1.2 主要藥品及試劑、儀器 自擬調氣湯（黨參20 g，白茅根、土茯苓各30 g，白術、茯苓、萊菔子、雞內金、佩蘭、丹參、川芎、川牛膝各15 g，陳皮、酒大黃、砂仁、清半夏各10 g，紫蘇葉、黃連各12 g），將藥材飲片浸泡至3 000 mL 蒸餾水中4 h，沸水煎煮1 h，過濾，留取濾液，將藥材殘渣置于1 500 mL 水中再次煎煮1 h，過濾，取濾液，合并兩次濾液后，蒸發濃縮，制成每毫升含5 g 生藥的制劑（北京同仁堂藥業）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業，規格6 mL︰30 mg）；氨磷汀（深圳市資福藥業，規格0.5 g）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；白介素（IL-1）試劑盒（北京義翹神州科技股份有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司）；增強型化學發光法（ECL）化學發光液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF）-α試劑盒（本生健康科技有限公司）；IL-6試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；Toll 樣受體4（TLR4）、核轉錄因子κB（NF-κB）p65 兔抗體、山羊抗兔IgG（艾博抗貿易有限公司）；蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（萬類生物科技有限公司）。BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司）；himac CR22N 高速冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；200 Pro 多功能酶標儀（帝肯貿易有限公司）；Intas Gel IX Imager凝膠成像儀（德國Royal 公司）；Atellica CH930 全自動生化分析儀（德國西門子公司）；石蠟切片機（瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 順鉑誘導大鼠腎損傷模型制備、分組及自擬調氣湯灌胃方法 將90 只大鼠隨機分為調氣湯低劑量組、調氣湯中劑量組、調氣湯高劑量組、氨磷汀組、模型組、正常對照組各15只。正常對照組不制備模型，其余5 組均參照文獻［2］方法制備腎損傷模型，即尾靜脈注射順鉑（2.5 mg/kg），1次/d，連續5 d，檢查腎組織病理變化及血清BUN、SCr 水平以驗證造模是否成功，若腎組織出現病理性損傷，血清BUN、SCr 顯著升高則認為造模成功；造模完成后，調氣湯低劑量組、調氣湯中劑量組、調氣湯高劑量組分別灌胃給予10、20、40 g/kg 調氣湯，濃度均為5 g/mL（以生藥含量計），氨磷汀組腹腔注射氨磷?。? mg/kg）［3］，模型組和對照組給予生理鹽水，1 次/d，連續60 d。

1.4 大鼠腎損傷評價指標檢測 ①血清BUN、SCR：每組取15 只大鼠，末次給藥24 h 后，按照35 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉，取腹主動脈血，4 ℃冰箱靜置1 h，以6 000 r/min速度離心10 min（4 ℃），取上清，使用全自動生化分析儀檢測血清BUN、SCR。②腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA 檢測每組取15只大鼠，末次給藥24 h取完腹主動脈血后，以頸椎脫臼法處死大鼠，取腎組織4份（各8.5 g），一份置于冰盒上，加入組織裂解液，組織勻漿器勻漿后充分裂解，以8 000 r/min 速度離心10 min（4 ℃），取上清液，使用ELISA試劑盒檢測腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA。③腎組織病理學檢查：取“②”處死大鼠腎組織，經甲醛（體積分數為4%）固定，制成4 μm 厚的石蠟切片，按照常規HE 染色方法分別依次使用蘇木精、伊紅染色后，中性樹膠封片，每只大鼠取3張切片，在顯微鏡下。每張切片隨機取5個視野，觀察病理性改變。

1.5 大鼠腎組織TLR4 和NF-κB mRNA、蛋白檢測 ①腎組織TLR4、NF-κB mRNA：采用RT-qPCR法。取“1.4 中②”處死大鼠腎組織，用PCR 試劑盒提取總RNA 并逆轉錄成cDNA，根據引物序列，使用PCR 儀檢測GAPDH、TLR4、NF-κB mRNA，以2-ΔΔCt表示，采用GAPDH mRNA 表達量作為參照，以TLR4、NF-κB mRNA 與GAPDH mRNA 的比值記為相對表達量。②腎組織TLR4、NF-κB 蛋白：采用Western blot 法。取“1.4 中②”處死大鼠腎組織，充分裂解勻漿后，以12 000 r/min 速度離心10 min（4 ℃），取上清，BCA 試劑盒測定總蛋白含量，取含50 μg 蛋白的裂解液，電泳分離，轉膜，牛血清白蛋白封閉，TLR4、NF-κB 及GAPDH 兔抗體按照1︰500的比例稀釋后，與蛋白條帶在4 ℃冰箱中孵育12 h，PBST 洗滌3 次，5 min/次，室溫下山羊抗兔IgG（1︰1 000 稀釋）孵育1 h，在凝膠成像儀中使用顯影液成像拍照，結果以TLR4、NF-κB 灰度值與GAPDH 的比值表示。

1.6 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清BUN、SCr 水平比較 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較（mmol/L，± s）

表1 各組大鼠血清BUN、SCr水平比較（mmol/L，± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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2.2 各 組 大 鼠 腎 組 織 TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比較 各組大鼠腎組織TNF- α 、IL-6 、IL-1 β 、SOD 、MDA 比較見表2。

表2 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比較（± s）

表2 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA比較（± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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2.3 各組大鼠腎組織病理學變化 正常對照組大鼠腎組織無異常改變，組織細胞形態正常，無病理性改變；與正常對照組比較，模型組腎小球萎縮，腎間質炎性細胞浸潤，并有纖維化改變，腎小管細胞壞死、脫落；與模型組相比，給予大鼠不同劑量的調氣湯后，調氣湯各劑量組及氨磷汀組腎小球病理學恢復，腎間質纖維化明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學變化（400×）

2.4 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較 大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較見表3。

表3 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較（± s）

表3 各組大鼠腎組織TLR4和NF-κB mRNA、蛋白比較（± s）

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與調氣湯低劑量組比較，cP<0.05；與調氣湯中劑量組比較，dP<0.05。

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3 討論

順鉑作為常用的抗腫瘤藥物，其臨床常見不良反應為腎損傷，主要以尿量減少、血肌酐升高等腎功能損害為主要臨床特征［4］。臨床中用于預防和治療順鉑誘導的腎損傷的藥物有限，泮托拉唑、褪黑素、茶堿等藥物用于預防和治療順鉑誘導的腎損傷的臨床試驗均以失敗告終［5］。目前，甘露醇及安磷汀具有顯著的腎損傷修復作用，且能夠顯著降低順鉑引起的腎損傷發生率。使用甘露醇治療順鉑引起的腎損傷時患者更容易發生水、電解質紊亂，引起低鈉血癥的發生［6］。研究［7］證實，安磷汀能夠顯著降低順鉑相關腎毒性的發生率，同時較少引起電解質紊亂。然而甘露醇及安磷汀在臨床研究中表現出有效率有限且不良反應大等缺點，因此順鉑誘導的腎損傷治療藥物的研發已成為臨床的迫切需求。

自擬調氣湯是由本課題組根據中國古典醫學著作中記載的多種調脾益腎方劑，以中醫學基礎理論為指導重新組合的一種具有調脾益氣補腎的中藥方劑，方中黨參、白術、大黃等藥材歸脾、胃經，具有養血生津、理氣健脾、利水祛濕等功效；茯苓、川牛膝、白茅根等藥材歸脾、腎經，具有涼血清熱、化瘀通經、利尿通淋等功效；川芎、丹參等藥材歸肝、心包經，具有活血行氣、涼血通經等功效。BUN 及SCr 作為臨床中常用的腎功能評價指標，其水平升高提示腎功能下降［8］；TNF-α、IL-6、IL-1β 是常用的反映體內炎癥反應發生及進展的體內敏感的炎癥信號分子，炎癥反應時TNF-α、IL-6、IL-1β 水平則會顯著升高［9］；SOD 作為腎組織中典型的抗氧化損傷分子，其是敏感的氧化應激損傷標志物，組織細胞受損時其水平降低，MDA 是機體脂質氧化的終產物，其水平的升高是細胞氧化損傷的典型表現［10］。本文結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清BUN 及SCr 水平升高，提示腎功能下降；同時腎組織TNF-α、IL-6、IL-1β 及MDA 升高，SOD 下降，提示大鼠腎組織出現明顯的氧化應激損傷及炎癥反應。與模型組比較，給予大鼠不同劑量調氣湯后，大鼠血清BUN 及SCr水平明顯降低，腎功能明顯好轉，同時腎組織炎癥因子水平下降，MDA 水平降低，SOD 水平升高，提示調氣湯起到活血化瘀，利尿通淋，行氣生津之功效，進而修復大鼠腎組織的炎癥損傷及氧化應激損傷。

TLR蛋白家族是機體產生非特異性免疫過程中不可或缺的重要蛋白家族，也是連接特異性免疫及非特異性免疫的重要信號傳遞分子，TLR4是該家族的主要成員之一［11］。近年來研究［12］發現，TLR4的異常激活是誘導腎臟損傷的重要因素，同時機體炎癥反應的產生及傳遞也與該蛋白密切相關。NF-κB通路及上下游相關蛋白的激活與炎癥反應加重有關［13］。在正常機體細胞中，NF-κB 與其抑制蛋白以非活性復合物的形式存在，在外源性刺激及毒性代謝產物的作用下，會促進其抑制蛋白的磷酸化，進而與NF-κB 解離，激活NF-κB 通路。研究［14］表明，NF-κB 能夠通過誘導激活天然免疫系統，從而介導急、慢性腎臟疾病的發病過程，并與多種腎臟疾病的發病及疾病轉歸密切相關。陳華等［15］發現，TLR4、NF-κB 水平的升高與大鼠腎組織炎癥損傷密切相關，抑制TLR4、NF-κB的異常激活能夠改善大鼠腎功能，緩解腎組織損傷；姜瑞鳳等［16］認為，TLR4/NF-κB通路的異常激活會導致腎損傷的發生，而松果菊苷能夠通過抑制TLR4/NF-κB 通路進而發揮其抗炎及腎損傷修復作用，由此可見TLR4/NF-κB 通路在腎損傷相關疾病的發生發展中起著重要作用。本研究給予順鉑引起的腎損傷大鼠調氣湯，大鼠腎組織TLR4、NF-κB 隨調氣湯劑量增加逐漸降低，同時體內炎癥因子減少及抗氧化應激相關分子水平則明顯升高，表明調氣湯能夠呈劑量依賴性抑制順鉑誘導腎損傷后腎組織TLR4/NF-κB 通路的激活，逆轉順鉑對腎組織造成的病理性損傷，同時修復受損腎細胞，恢復腎功能。

總之，自擬調氣湯具有顯著的腎功能恢復作用，其可能通過調節TLR4/NF-κB 信號通路，提升腎組織抗氧化應激能力，抑制炎癥反應的發生及進展，進而修復腎組織病理損傷。