氫氧化鑭灌胃對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥的治療作用及其機制

王魯豫，高原，王琪雯，王勝男，元曉榮，張春生，日瓦德，李剛

內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110

成人腎臟的自我再生和恢復能力非常有限，隨著年齡的增長、受傷或各種疾病的出現，成人腎功能會下降，當腎功能下降到一定程度時會發展為慢性腎臟病（CKD）［1-3］。慢性腎功能衰竭高磷血癥是慢性腎臟疾病患者常見的并發癥之一，臨床主要采用磷酸鹽結合劑或非磷酸鹽結合劑治療，然而這些藥物治療效果有限，且可能伴有不良反應。氫氧化鑭（LH）是一種磷酸鹽結合劑，通過降低血液磷水平而抑制血管鈣化形成［4-5］，且伴隨有改善慢性腎功能衰竭高磷血癥持續發展的作用，但其可能的機制并未被發現。本研究觀察了LH 對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6 周齡雄性Wistar 大鼠30 只，體質量（200 ± 20）g，購自維通利華生物科技有限公司（北京，SCXK 2016-0006）。飼養于內蒙古醫科大學實驗動物中心屏障區大鼠飼養間，大鼠維持在12 h 的光/暗循環中，環境溫度為21～22 ℃，濕度為40%～50%，自由飲食。實驗開始前，大鼠適應性喂養1 周后進行后續實驗。

1.2 主要試劑及儀器 1.2%高磷飼料（北京科奧協力飼料有限公司，2021070107）；烏拉坦（DC08BA 0021，生工生物工程（上海）股份有限公司）；LH（實驗室合成，批號：2020 年9 月，純度：96%）；腺嘌呤（CAS：7324-5，Sigma-Aldrich）；磷檢測試劑盒（C006-1-1，南京建成生物工程研究所）；肌酐測定試劑盒（C011-2-1，南京建成生物工程研究所）；鈣測定試劑盒（C004-2-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮檢測試劑盒（南京建成生物工程學院C013-2-1）。Mo?lecular Devices 多功能酶標儀（Spectra Max i3x，美谷分子儀器有限公司）；高速冷凍離心機（3-18K，Sig?ma）；Leica 顯微鏡（Gmb H，Wetzlar，Germany LEICA DM 2000）；脫水機（Donatello，DIAPATH）；包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；凍臺（JB-L5，武漢俊杰電子有限公司）；組織攤片機（KD-P，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）。

1.3 大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥模型制備及LH給予方法 30只Wistar大鼠按隨機數字表分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。對照組不制備慢性腎功能衰竭高磷血癥模型，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組制備慢性腎功能衰竭高磷血癥模型，即大鼠每日灌胃2% 腺嘌呤混懸液（200 mg/kg），連續2周；在3～4周內，所有模型大鼠隔天灌注腺嘌呤混懸液；在4周末，從大鼠眼底靜脈叢采血，利用Ca、PI、Scr、BUN 試劑盒測定Ca、PI、Scr、BUN，與對照組相比，模型組肌酐、尿素氮、磷和鈣水平顯著性升高，則證明慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠模型建立成功。制模成功后，低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃給予0.1、0.2、0.4 g/kg 的LH，共8周；模型組和對照組不予處理。

1.4 大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 檢測 給藥8 周后，分別從腹主動脈采集各組大鼠血液樣本，分離血清，并將其保存在-80 ℃環境中。采用Ca、PI、Scr、BUN試劑盒檢測各組血清Ca、PI、Scr、BUN。

1.5 大鼠腎臟組織病理學檢測 給藥8 周末處死動物，并取腎臟組織，保存于-80 ℃環境中。取對照組、模型組、低、中、高劑量組大鼠腎臟組織，分別行HE 染色和Masson's 染色。HE 染色步驟：將腎臟組織切片固定，用蘇木精染色使細胞核呈藍色，在酸性溶液中漂洗去除多余的染料，接著用酸性染料染色。最后，使用脫水劑轉移染料并加入透明劑，在顯微鏡下觀察。Masson's 染色步驟：固定腎臟組織切片，溶解蠟質，用檸檬黃或橙G 染色使肌纖維、膠原和骨質呈黃色或橙色，洗去多余染料，再用苯胺藍染色，最后轉移染料并加入透明劑，在顯微鏡下觀察組織切片。

1.6 大鼠腎功能差異代謝物篩選 處死前將所有動物提前1 天放入代謝籠，收集大鼠尿液，保存于-80 ℃環境中，備用。將對照組、模型組及低、中、高劑量組尿液樣品與預冷的甲醇按1︰3 的比例孵育10 min 以沉淀蛋白質。在4 ℃下以12 000 r 的速度離心15 min，收集上清液待測。QC：取各組上清液等比混合后加3 倍甲醇等比混合后待測。QC 樣本聚合較集中，說明儀器運行穩定，數據可靠，所建立方法可行，可用于后續大批量進樣。5 組待測尿液樣品上清液用Dionex Ulti Mate 3000 快速分辨率液相色譜儀和Q Exactive 質譜儀分析。UPLC 色譜條件：Hypersil GOLD 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm），流速為0.35 mL/min；進樣量為5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫梯度，0～1 min，98%A；1～9 min，2%A；9～12 min，2%A；12～12.1 min，98%A；12.1～15 min，98%A。質譜條件：使用電噴霧離子化源（ESI），溫度為350 ℃；毛細管內電壓為3.8/3 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣壓為40 arb；輔助氣壓為10 arb。采集質量范圍為50～1 000 m/z。將上述液質條件下采集到的尿液中小分子代謝物原始數據進行以下分析預測可能的代謝物和代謝通路［6-7］。a. 根據QC 樣本的變異系數（CV），篩選所獲得數據矩陣CV<30%的變量，減少來自基線或噪聲變量的影響；b. 利用軟件SIMCA-P（v14.1）進行主成分分析（PCA）［8］和正交—偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）［9］，了解組間變化趨勢；對不同組別的尿液代謝產物進行分析。c. 根據一級質譜信息分析不同離子模式下特征峰保留時間、質核比，并利用二級碎片信息搜庫（HMDB、Metlin、Mo?NA以及帕諾米克自建標準品數據庫）進行比對。d.利用MetaboAnalyst 分析工具對篩選到的差異性代謝物進行代謝通路分析。變量對投影值的影響被用來確定值VIP>1.0 和P<0.05 的顯著變量。使用顯著變量來識別光譜峰。用Spearman 相關系數評估屬的豐度與大鼠行為的相關性。

1.7 大鼠腎功能差異代謝物GO 功能、KEGG 富集分析 對模型組和對照組、模型組和高劑量組的尿液樣本篩選到的差異代謝物進行GO 功能和KEGG富集分析。對差異代謝物進行預處理，包括數據歸一化和過濾低表達代謝物。GO功能富集分析：對目標代謝物進行GO 功能富集分析。使用在線工具Enrichr或R包clusterProfiler 進行分析。將差異代謝物列表輸入到相應的工具，選擇物種和GO 數據庫版本。進行富集分析，獲取富集的GO 術語和相關統計結果。通過設定一定的統計指標（如p 值或FDR 校正的p 值）來確定顯著富集的GO 術語。KEGG 分析主要針對于生物體中的代謝通路進行分析：即對GO富集到的代謝物進行KEGG功能富集分析，其余操作步驟同GO分析。

1.8 統計學方法 采用Graph Pad Prism 8.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 給藥8 周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 水平比較 大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN 水平比較見表1。

表1 給藥8周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN水平比較（± s）

表1 給藥8周后各組大鼠血清Ca、PI、Scr、BUN水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，＃P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

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2.2 各組腎臟組織病理學變化 對照組腎小球內皮細胞呈扁平形狀；腎小管上皮細胞呈立方形狀；細胞核呈深紫色，胞質呈粉紅色，基底膜呈現出深染色；腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞染色均勻，細胞核清晰可見，細胞形態規整。與對照組相比，模型組大鼠腎臟樣本顯示出許多囊性擴張的小管、腺嘌呤結晶、蛋白鑄型和腎小球壞死皺縮；腎間充質細胞伴有大量的炎癥細胞浸潤和間充質纖維化。低劑量組及中劑量組和高劑量組腎損傷、腎小管囊性擴張、炎癥細胞浸潤均得到改善，高劑量改善更為明顯，顯著減輕了腎小管囊性擴張、炎癥細胞浸潤以及纖維化程度，且LH 呈劑量依賴性延緩大鼠腎損傷（詳見圖1～2）。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學變化（HE染色）

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學變化（Masson's染色）

2.3 大鼠腎功能差異代謝物篩選結果 用液相色譜—串聯質譜儀對五組動物尿液進行鑒定，正離子模式下共鑒定出4 370 個變量和負離子模式下732個變量。對高劑量組和模型組中檢測到的代謝物進行差異篩選，共檢測出47 個差異代謝物。其中，正離子模式篩選出9 個差異代謝物，負離子模式篩選出38個差異代謝物。由于空間的限制，箱線圖最多顯示了50 個特征。密度圖是基于所有的樣本而繪制的。我們歸一化前后的Box 圖和核密度圖（圖3A）。PCA 顯示，低劑量組、中劑量組、高劑量組尿液樣本間組分有很好的重復性均無明顯分離趨勢（圖3B～C）。接下來，我們又計算了一下每組離散情況（圖3D），QC 作為數據的標準依據。PLS-DA 得分圖可看出代謝物分離良好，在給藥組內的離散度減小。該模型具有較高的解釋率和預測率（R2Y=0.92 和Q2Y=0.92）（圖3E～F）。排列實驗表明，R2和Q2截距分別為0.49和0.013。

圖3 各組大鼠尿液小分子代謝物分析及PCA、PLS-DA分析圖

2.4 大鼠腎功能差異代謝物GO 功能、KEGG 富集分析結果 根據以上結果，我們進行了模型和對照組、模型和高劑量組之間的S-plot 分析。由圖可見，組別間分散程度較高，代謝物差異顯著（圖4A、B）。通過相關分析將高劑量和模型組中47 個差異代謝物在各組中的表達情況根據VIP值和P值進行組間差異代謝物的篩選（圖4C）。共篩選出25 種顯著差異代謝物，分別為DL-瓜氨酸、2，3-前列腺素、鳥氨酸、2-磺氧基甲基、對羧基苯磺酰胺、1，2-二甲基呋喃-5-、3-苯基磺酰胺醛、對羥基苯乙烯酯、精氨酸、氯胺酮、L-阿拉伯糖醇、4-脫甲基葡萄堿、D-丙氨酰-D-丙氨酸、6-叔丁基磺酸、氨基二環二羧酸、1D-肌醇、乙酸-2-氨基二酸、α-氨基己二酸半醛、γ-氨基丁酸、11-4-氯苯胺、7-甲基黃嘌呤、β-D-葡萄糖核酸、α-胸腺肽、3-脫氧-D-甘露-2-新酮糖酸銨（圖4C）。由圖可以得出瓜氨酸、2，3-前列腺素、鳥氨酸、2-磺氧基甲基、對羧基苯磺酰胺、1，2-二甲基呋喃-5-、3-苯基磺酰胺 醛、對羥基苯乙烯酯、精氨酸、氯胺酮在高劑量組高表達（圖4C）。接下來，我們又通過GO 篩選高劑量和模型組中標志性差異代謝物富集到代謝途徑，篩選出25 條代謝途徑，其中尿素循環較為顯著（圖4D）。將25 條代謝途徑通過KEGG 富集分析顯示，與慢性腎功能衰竭高磷血癥相關的代謝通路共8 條，分別為精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉換、磷酸戊糖途徑、賴氨酸降解途徑、D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝、抗壞血酸鹽和醛酸鹽代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（圖4E）。

圖4 對照組和模型組的S-plot分析及高劑量組和模型組的S-plot、GO、KEGG分析圖

3 討論

慢性腎功能衰竭高磷血癥是慢性腎臟疾病患者常見的并發癥之一，其臨床特征包括：①高磷血癥：血清磷濃度升高是慢性腎功能衰竭高磷血癥的主要特征［10］。正常情況下，腎臟能夠調節磷的排泄，但在腎功能不全的情況下，磷的排泄減少，導致血磷濃度升高。②骨骼病變：高磷血癥會導致鈣磷代謝紊亂，進而引起骨骼病變，如骨質疏松和骨折。③血管鈣化：高磷血癥會促進血管內鈣化，增加動脈粥樣硬化和心血管事件的風險。④肌肉癥狀：高磷血癥還可引起肌肉癥狀，如肌無力和肌肉痙攣［11-13］。在過去，治療慢性腎功能衰竭高磷血癥主要采用磷酸鹽結合劑，如磷酸鋁凝膠或碳酸鈣，以幫助降低血磷濃度。這些藥物通過與食物中的磷結合，減少磷的吸收。此外，還可以采用非磷酸鹽結合劑，如鈣離子交換樹脂（如醋酸鈣），以增加磷的排泄。然而這些藥物治療高磷血癥的效果有限，且可能伴有不良反應，如鈣負荷過高導致高鈣血癥。因此，近年來一些新型藥物被引入臨床，如鑭制劑，其與磷結合形成不溶性磷酸鑭鹽在腸道內排除，從而減少磷酸鹽的吸收，且不影響維生素吸收且無明顯毒性。總的來說，治療慢性腎功能衰竭高磷血癥的藥物多樣，效果因個體差異而異［14］。

LH是一種磷酸鹽結合劑，用于治療慢性腎功能衰竭高磷血癥。其藥理學特征包括：①磷酸鹽結合作用：LH 能夠與食物中的磷酸鹽結合，形成不溶性的鑭磷酸鹽，從而減少磷的吸收。這樣可以降低血磷濃度，從而緩解慢性腎功能衰竭高磷血癥的癥狀。②高選擇性：LH 對磷酸鹽具有高度選擇性，不會與其他重要的陽離子（如鈣、鎂、鋁等）結合，從而減少了與其他礦物質的相互作用和不良反應的可能性。③鑭離子毒性較低：相比于其他稀土元素，鑭離子的毒性較低。研究［4］表明，LH 的劑量在治療范圍內時，對腸道和骨骼沒有明顯的毒性影響。另外，LH 能夠有效地降低血磷濃度，并且與傳統的磷酸鹽結合劑相比，其不良反應更少。此外，LH 還可以改善患者的生活質量，并減少骨骼病變和血管鈣化的發生［5］。通過本文結果可知，與模型組相比，給予LH 各劑量組治療后慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠血清磷、肌酐、尿素氮水平均顯著降低，且LH 具有劑量依賴性；另外，在LH 治療后，腎損傷、腎小管囊性擴張和炎癥細胞浸潤均得到改善；高劑量組更優，顯著減輕了腎小管囊性擴張、炎癥細胞浸潤以及纖維化程度，且LH 呈劑量依賴性延緩慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠腎損傷。因此推斷，LH對大鼠慢性腎功能衰竭高磷血癥具有治療作用［15］。

本研究我們使用了代謝組學來預測慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠有效候選藥物的可能機制。在以前的代謝組學研究中，通常給大鼠注射代謝物來觀察代謝流的變化［16-17］。本文結果顯示，瓜氨酸、鳥氨酸、精氨酸為尿素循環代謝途徑的主要氨基酸，參與腎臟代謝。在人體內，精氨酸主要參與尿素循環的代謝過程［18］。精氨酸激發的第一個活性酶就是參與尿素循環的有五個主要的酶之一，腎臟也包含所有尿素循環酶。在尿素循環的兩個關鍵步驟中，精氨酸主要來源于瓜氨酸、鳥氨酸合成。肝臟和腎臟都通過尿素循環（也稱為鳥氨酸循環）將氨轉化為尿酸和尿素。尿素循環和多胺代謝、一氧化氮合成、檸檬酸循環和精氨酸代謝之間的代謝聯系使數據解釋變得復雜。腎衰竭的患者當血液中精氨酸處于低水平時，補充適量的精氨酸，對患者是有益的。我們的結果表明，口服LH 可以促進大鼠精氨酸的吸收來介導尿素循環，進而延緩腎損失。在我們的研究中發現慢性腎功能衰竭高磷血癥導致的腎臟谷氨酸合成減少。另外，精氨酸的腸道吸收涉及一個與賴氨酸、鳥氨酸和胱氨酸共享的運輸系統［19］。該轉運系統依賴于三磷酸腺苷和鈉，并具有底物特異性。理論上，該轉運體在慢性腎功能衰竭高磷血癥存在時可能會受到影響。一例人類短腸綜合征和慢性腎功能衰竭相關的繼發性高氨血癥已被報道。同時鳥氨酸血漿水平的下降支持了這一理論。因此，補充精氨酸、瓜氨酸，以促進尿素循環，降低血氨，有利于延緩慢性腎損傷［20-21］。

總之，LH 可能通過尿素循環、精氨酸代謝等途徑來改善慢性腎功能衰竭高磷血癥大鼠腎功能持續衰竭的作用，并且高劑量LH效果更顯著。