miR-1306-5p在AML患者骨髓組織單個核細胞中的表達及對HL60細胞增殖凋亡和遷移侵襲調控作用觀察

伍燕平，王蒙，張平平，朱凱，袁媛，李佳佳

蚌埠醫學院第一附屬醫院血液科，安徽蚌埠 233003

急性髓系白血病（AML）是常見的血液系統惡性腫瘤，特征為骨髓中未成熟髓系造血細胞異常增殖和分化［1-2］。AML 的發病率為3.7/100 000，病死率為2.7～18/100 000［3-4］。HL60是人原髓細胞白血病細胞，多用于AML 的功能實驗研究［5］。盡管過去幾十年對AML 的研究不斷深入提高了對該病的認識與理解，但其發病機制尚未完全闡明。因此，闡明AML發生發展的基礎機制，有助于改善AML的治療效果。微小RNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，在轉錄后水平上調節基因表達，已被確定為正常和惡性生物過程中的主要調節因子［3］。在AML 中，miRNA 的失調與造血前體的不同分化階段有關，因此miRNA 的作用在于造血和腫瘤發生具有重要作用［6］。近年研究［7-9］發現，微小RNA-1306-5p（miR-1306-5p）在多種腫瘤中低表達并發揮抑癌作用，但目前其在AML 發生發展中的具體作用機制尚不明確。2021 年6—12 月，我們觀察了miR-1306-5p 在AML 患者骨髓組織單個核細胞中的表達，以及對HL60 細胞增殖凋亡和遷移侵襲調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 HL60細胞（無錫懷信生物公司）。RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒（Thermo Fisher公司），CCK8檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒（Abcam 公司），Transwell（Corning 公司），RI-PA細胞裂液（Boster公司），1%青鏈霉素10%胎牛血清（Gibco公司），質粒（上海 Genepharma 公司）。miR-1306-5p mimics sense：5′-CCACCUCCCCUGCA AACGUCCA-3’，miR-1306-5p mimics antisense：5′-UG?GACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；miR-1306-5p in?hibitor：5′-UGGACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；U6 sense：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 antisense：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-1306-5p reverse primer：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGTGGACGTT-3′，miR-1306-5p sense：5′-AATACCACCT CCCCTGCA-3′。

1.2 骨髓組織單個核細胞miR-1306-5p 檢測 取2021 年6—12 月收治的AML 患者和再生障礙性貧血（AA）患者的骨髓血標本各2 mL。該研究方案經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會簽署批準，所有參與者均獲得知情同意，所有受試者均同意并同意本研究。將AA和AML患者的骨髓血標本各2 mL分別置于EDTa_K2 管中，用紅細胞裂解液提取單個核細胞。用TRIzol 提取總RNA，后取RNA 樣品1 μL，使用超微量分光光度計SMA1000 測量總RNA的純度與濃度，并收集濃度在30～70 ng/μL 之間且OD260/280 比值在1.8～2.0 之間總RNA 樣本。按照miRNA 逆轉錄試劑盒（MR101-01/01/02，南京諾唯贊生物公司）說明書逆轉錄出cDNA，在PCR 儀上擴增特定DNA 片段（單樣本均設置3 個復孔進行對照）計算其均值，AML 患者與AA 患者均以U6 作為內參基因采用一體化miRNA RT-qPCR 檢測試劑盒（Q711-02，南京諾唯贊生物公司）檢測。逆轉錄體系10 μL，反應條件如下：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。PCR 反應階段體系20 μL，循環條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，循環次數40 次。采用2-ΔΔCt法計算miR-1306-5p相對表達水平。

1.3 HL60 細胞培養、分組、過表達和敲低miR-1306-5p質粒轉染效率檢測 將HL60細胞放在加入1%青鏈霉素、10%胎牛血清的DEME 培養基中，并置于37 ℃含有5%CO2的細胞箱中培養，每隔24 h進行傳代。取生長良好的HL60細胞接種于6孔板，1×105/孔，當細胞生長至70%以上融合時進行后續轉染。將HL60細胞各分為1、2、3、4組。1組為過表達對照組，轉染mimic control；2 組為miR-1306-5p 過表達組，轉染miR-1306-5p mimics；3 組為敲低對照組，轉染Inhibitor control；4 組為miR-1306-5p 敲低組，轉染miR-1306-5p inhibitor。使用Lipofectamine? 2000（美國Invitrogen）轉染試劑盒，所有操作均嚴格按照說明書進行。轉染后將各組細胞置于37 ℃培養箱中繼續培養48 h。轉染48 h 取各組細胞，RT-PCR法檢測各組miR-1306-5p，確定miR-1306-5p 轉染效率。1、2、3、4 組miR-1306-5p 相對表達量分別為3.55 ± 0.40、5.64 ± 0.28、3.65 ± 0.29、1.64 ±0.17，2 組較1 組miR-1306-5p 相對表達量增高，4 組較3 組miR-1306-5p 相對表達量降低（P均<0.05），提示miR-1306-5p質粒轉染成功。

1.4 轉染過表達和敲低miR-1306-5p 質粒的HL60細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將各組HL60細胞（2×103/孔）接種于96孔板中。使用RPMI1640培養基（含10%胎牛血清）進行孵育。轉染48 h 后，每個孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，37 ℃孵育3 h。測定酶標儀在450 nm 吸光度時的光密度OD 值。以OD 值代表各組細胞的增殖活力，每組實驗重復3次，取平均值。

1.5 轉染過表達和敲低miR-1306-5p 質粒的HL60細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞儀。轉染48 h后的各組HL60 細胞用預冷的PBS 重懸，用PI（5 μL，50 μg/mL）和Annexin V-FITC（10 μL）染色。避光室溫孵育15 min，采用流式細胞儀進行檢測各組細胞的凋亡率。實驗重復3次，取平均值。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.6 轉染過表達和敲低miR-1306-5p 質粒的HL60細胞遷移、侵襲能力檢測 采用Transwell 法。侵襲能力，將100 μL 的Matrigel 膠均勻地鋪在Transwell小室，在培養箱中聚合成薄膜。調整HL60 細胞濃度為2×105/mL，上室中加入細胞懸液200 μL，下室中加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養基。24 h后取出上室用多聚甲醇固定30 min，PBS 清洗兩次，結晶紫染色10 min，PBS 液漂凈，用棉簽擦去未侵襲細胞，干燥后觀察，隨機選取5 個低倍鏡視野（×100），計算平均數后以代表細胞的侵襲能力。遷移能力，無需在Transwell 小室中加入Matrigel 膠其余同侵襲步驟。

1.7 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相對表達量比較 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相對表達量分別為0.27 ± 0.07、1.00 ± 0.08，兩者比較，P<0.05。

2.2 各組細胞OD 值、細胞凋亡率、遷移細胞數、侵襲細胞數比較 細胞OD 值、細胞凋亡率、遷移細胞數、侵襲細胞數比較見表1。

表1 各組細胞OD值、細胞凋亡率、遷移細胞數、侵襲細胞數比較（± s）

表1 各組細胞OD值、細胞凋亡率、遷移細胞數、侵襲細胞數比較（± s）

注：與mimics control組比較，*P<0.05；與inhibitor control組比較，#P<0.05。

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3 討論

AML 是血液系統常見的高度異質性的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的重要原因。其特征主要表現為髓系祖細胞的增殖失控，使未成熟的前體細胞在骨髓中異常聚集，從而引起正常成熟血細胞生成不足［10］。盡管近年來隨著臨床和實驗室診斷方法不斷完善，使AML 的治療有了顯著改善，但是AML 的預后仍然很差，5 年生存率仍低至30%［11］。AML 仍是癌癥相關死亡的重要原因，AML 發病機制復雜多樣，尚未完全闡明，因此在此研究我們選擇AML 原髓細胞株HL60，設計miR-1306-5p 過表達和敲低質粒轉染HL60 細胞株，為AML 潛在的發病機制進行闡明及研究，以期改善AML 的治療效果，提高患者生存率。

越來越多的證據表明，一些miRNAs 參與了AML的發生與發展，使其成為AML治療的治療靶點和潛在的診斷生物標志物［12］。然而，miRNAs 在AML 進展中的確切功能仍未得到充分的研究。miRNA 是一系列小的非編碼RNA，在轉錄后或翻譯水平的上調控基因表達［4，13］。miRNAs 在人體中具有非常強大的調節功能，調控范圍很廣，其與腫瘤的重要相關性已被大量研究證實。它在細胞分化、增殖和凋亡等各種生物過程中起著重要的作用。越來越多的證據表明，miRNAs 是AML 的關鍵調控因子［4，6］。DEBERNARDI 等［14］通過對HOX 家族基因的初步研究的文獻綜述，檢測到5 個可調控HOX 家族基因的特異性miRNA。在隨后的研究中，BRYANT等［15］發現，在伴有NPM1 突變的AML 患者中，miR-10a 的表達異常高。下調MiR-10a 可促進AML 細胞的凋亡。研究人員發現，miR-10a 通過抑制兩個下游靶基因KLF4 和RB1CC1 來抵抗細胞凋亡。隨著先進的檢測技術，AML 的miRNA 表達譜將不斷提高。miRNAs 將在AML 的發生和發展的診斷中發揮新的作用，為AML 的診斷和靶向治療提供新的思路。miR-1306-5p 涉及多種疾病以及腫瘤的發病機制，在多種不同類型的腫瘤組織或細胞中與其對應相關對的正常對照標本中，miR-1306-5p的表達量均表現出具有差異，并且差異均具有統計學意義。CHEN 等［12］研究發現，miR-1306-5p 可以通過靶向BIK 從而降低腦缺血/再灌注損傷。有研究［16］表明，miR-1306-5p 可以通過調控人釉質母細胞瘤細胞系AM-1 細胞中與釉質生成不全癥相關的基因來調節成釉細胞分化。此外DANG 等［17］研究發現，lncRNA AC007207.2 可以通過miR-1306-5p/SIRT7 軸促進骨肉瘤細胞的增殖和轉移，并且還發現miR-1306-5p發揮著骨肉瘤細胞惡性行為的作用，并抑制骨肉瘤細胞的惡性行為。一項研究［18-19］表明，miR-1306-5p在阿爾茲海默病患者中的表達明顯降低，其在阿爾茲海默病發展中起到保護作用。據報道，miRNAs通過調控幾個不同的靶基因，具有重要的生物學功能［16-17］。WANG 等［7］的研究中發現，過表達miR-1306-5p 時，PI3K/AKT/mTOR 信號通路被抑制，miR-1306-5p 與SLCO2A1 之間存在間接的相關性，表明SLCO2A1 是miR-1306-5p 的靶點。文獻［8］報道，在胰腺導管腺癌（PDAC）中還發現miR-1306-5p的另外一個靶基因ADP-核糖基化因子（Arf）樣蛋白4C（ARL4C）。其他研究顯示，ARL4C 在胰腺導管腺癌中呈高表達。ARL4C 在PDAC 細胞中的表達受到miR-1306-5p 的負調節，miR-1306-5p 是ARL4C 的上游調控基因，抑制ARL4C 的翻譯，從而阻礙ARL4C 的表達，抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡［8］。在GAO 等［20］的研究中發現，在AML 細胞中下調miR-1306-5p 與細胞增殖減少和凋亡率增加相關，并且此過程通過miR-1306-5p 直接調節PHF6 的表達發揮作用。從以上的研究成果我們可以看出，miR-1306-5p 在多種腫瘤包括AML的發生和發展中調控著腫瘤組織和細胞的生物學功能。

本研究顯示，與AA 患者比較，AML 患者miR-1306-5p 相對表達量低；與mimics control 組比較，miR-1306-5p mimics 組OD 值、侵襲細胞數、遷移細胞數降低，凋亡率升高；與inhibitor control 組比較，miR-1306-5p inhibitor 組OD 值、侵襲細胞數、遷移細胞數升高，凋亡率降低。提示AML 患者骨髓組織單個核細胞miR-1306-5p 表達降低，轉染過表達miR-1306-5p質粒的HL60細胞增殖、遷移、侵襲能力減弱及凋亡能力增強，敲低miR-1306-5p 質粒的HL60 細胞增殖、遷移、侵襲能力增強及凋亡能力減弱。

綜上所述，本研究通過干擾AML 細胞中miRNA-1306-5p的表達水平，去探索miRNA-1306-5p與AML 的關系。研究結果發現，miRNA-1306-5p 的變化能影響AML 細胞的生物學特性。因此我們有理由認為，miRNA-1306-5p 可能AML 在內的腫瘤的發病機制相關，并且有可能成為AML 的預后評估指標之一，但是在miR-1306-5p 涉及對AML 細胞生物學功能的影響，還需進一步研究。