HBV相關肝細胞癌抑癌基因甲基化異常及機制的研究進展

陳映均 劉同剛

原發性肝癌目前是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居世界第七位，死亡率已位居世界第三位[1]。肝細胞癌（HCC）作為原發性肝癌中最為多見的組織學類型，占原發性肝癌總數的85%～90%[2]。肝細胞癌是一種復雜的多基因多因素疾病，它的發生發展受遺傳因素和環境因素共同作用。多種研究表明，影響肝癌的因素包括乙型肝炎病毒（HBV）感染、丙型肝炎病毒（HCV）感染、飲酒、非酒精性脂肪性肝病等[3]。其中，HBV 感染是我國公認的導致肝臟細胞發生癌變的主要危險因素[4]。HBV 誘導的HCC 的發病機制涉及點突變、染色體畸變、表觀遺傳學變化等多個方面[5]。愈來愈多證據顯示表觀遺傳機制參與了惡性腫瘤的發病過程。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾中最主要的修飾類型之一，通過調控基因表達進而引起腫瘤的發生[6-7]，在轉錄調控及基因表達過程中發揮著至關重要的作用[8-9]。HBV 感染可能會加快基因甲基化的進程，繼而導致肝細胞癌的發生[10-11]。DNA 甲基化及其誘導的表觀遺傳的改變，為探索HCC 更具特異性的生物標志物及更具針對性的治療手段提供了幫助[12-13]。HBV 感染作為HCC 發病的最重要危險因素之一，它如何引起宿主細胞中腫瘤抑制基因的異常高甲基化的機制仍不清楚。因此，亟待進一步了解HBV 相關HCC 的分子機制，尋找新的基因標記物或靶點，以便早期診斷及治療肝癌。

1 HBV感染與肝細胞癌

HBV 慢性感染已經被公認為21 世紀肝癌發病的高危因素[14]。以往多種研究表明，影響肝癌的因素包括HBV 感染、HCV 感染、飲酒、非酒精性脂肪性肝病、長期攝入黃曲霉素、肥胖、2 型糖尿病和吸煙等[3]。其中，HBV 感染是我國公認的導致肝細胞發生癌變的主要危險因素。有數據證實我國HBV 相關肝細胞癌患者發病率約占肝細胞癌患者總數的80%以上[2]。肝細胞癌的發病率及死亡率一直居高不下，原因在于HBV 相關肝細胞癌的早期診斷及晚期治療方法有限，對化療和放療的耐藥性強，肝臟移植供體資源短缺[15]，肝移植復發率高，以及人們對疾病或日常健康管理的認識不足。肝細胞癌的發生與HBV 的直接和間接感染機制都有關，HBV 感染HCC 的因素包括慢性感染、HBV 復制水平高、HBV 基因型、HBV 整合、HBV 突變體和HBV 編碼腫瘤蛋白[16]。此外，慢性HBV 感染時，宿主免疫反應引起的反復的肝臟炎癥可導致肝臟纖維化和肝硬化，加速肝細胞的更新增殖速率，促進突變因子的累積。因此，控制HBV 已刻不容緩，探究DNA 甲基化引起HBV 相關肝細胞癌的作用機制對肝細胞癌的預后具有重要意義。

2 HBV相關肝細胞癌與DNA甲基化

DNA 甲基化作為重要的表觀遺傳修飾之一，其并沒有改變遺傳信息，只是改變了DNA 的可讀性，并通過后續mRNA 轉錄抑制使基因失活[17]。研究已經證實許多顯著基因的異常甲基化表達在肝癌細胞成瘤過程中發揮了作用[18]。DNA 甲基化是以原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化為特征[19]，被認為是癌癥進展中的重要事件。越來越多的證據表明，DNA 甲基化可以引起特異性抑癌基因（tumour suppressor gene，TSG）的失活和不同癌基因的異常激活[20]，異常的TSG 甲基化模式與HBV 相關肝細胞癌的發生有直接關系。表觀遺傳調控基因啟動子中的CpG 島的高甲基化可能導致抑癌基因的沉默，進而導致腫瘤的發生[21-22]。HBV 感染過程中導致肝細胞癌風險增加的誘因可能是DNA 甲基化轉移酶（DNMTs）基因的上調[23]。DNA 甲基化與去甲基化之間的循環過程通常是HBV 感染導致DNMTs 表達變化的過程，特別是從肝硬化到肝細胞癌的過程[24]。研究證實，HBV 感染與DNA 甲基化相互作用，相互影響。HBV 的感染是導致肝細胞癌發生DNA 甲基化的一個誘因，而DNA 甲基化也會進一步促進HBV 相關的肝細胞癌的發展[25]。

3 HBV相關肝細胞癌的抑癌基因異常甲基化和表達

在HBV 相關腫瘤中，HBV 基因組受到廣泛的DNA 甲基化調控[26]。HBV 相關肝細胞癌中，許多基因受表觀遺傳學作用出現異常甲基化現象，如RAS 相關結構域家族蛋白1A（RAS association domain family 1A，RASSF1A）、細胞周期調控家族基因（cell cycle regulation family genes，P16）、谷胱甘 肽-S- 轉 移 酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）、分泌卷曲相關蛋白（secretfrizzered-related proteins，SFRP）、細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）、長散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）等在HBV 相關肝細胞癌中均存在不同程度的異常甲基化[27-32]。DNA 甲基化是HBV 相關肝細胞癌中腫瘤抑制基因失活的重要渠道，抑癌基因啟動區甲基化的異常升高會調節基因轉錄，影響基因表達從而推動腫瘤發生和發展。

3.1 RASSFlA 的異常甲基化和表達

啟動子的高甲基化可能導致腫瘤組織中抑癌基因的沉默[21-22]。其中，RASSF1A 是RASSF1 基因的八個亞型之一，位于人類3 號染色體p21.3 上，是一種重要的具有多種生物學功能的腫瘤抑制因子[21]。癌癥發生時，RASSF1A 往往由于突變、雜合性喪失及最常見的啟動子高甲基化等因素而被滅活[33]。研究發現，RASSF1A 的表觀遺傳失活在多種類型癌癥中都有表現，當前RASSF1 啟動子甲基化研究多集中于表觀遺傳腫瘤生物標志物上[34-35]。Peng 等[10]抽取HBV/HCV 相關HCC 樣本1 015 份，非腫瘤對照1 225 份，檢測到與非腫瘤樣本相比，HBV/HCV 相關腫瘤病例中RASSF1A 甲基化頻率顯著增加。這表明RASSF1A 異常甲基化可能參與了HBV/HCV 誘導的肝癌的發生和進展，RASSF1A 甲基化表達可能是一個潛在的表觀遺傳生物標志物。Xu 等[27]基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫，通過Meta 分析和Kaplan-Meier 生存分析發現RASSF1A 啟動子甲基化率在HCC 患者中顯著高于非腫瘤患者和健康人群，且與HBV 感染陽性和腫瘤大小顯著相關。并且，ROC 曲線證實RASSF1A 啟動子甲基化可能是反映HCC 預后的一個標記[36]。這些研究表明，RASSF1A 啟動子高甲基化是HCC 早期診斷和預后評價的生物標志物。

3.2 P16 基因的異常甲基化和表達

P16 基因是一個對細胞進行周期性調控的基因家族，位于人類染色體9p21 上，由3 個外顯子和2 個內含子組成，是一種周期蛋白依賴的激酶抑制劑。P16 作為抑癌基因，其啟動子能被甲基化沉默，并且研究發現在人類腫瘤疾病的進程中，其活性常因微環境穩態的破壞呈現紊亂的狀態[37]。已有P16 基因啟動子甲基化出現在HBV 相關HCC 報道中。Li 等[28]Meta 分析鑒定出GSTP1 與P16 基因啟動子甲基化對HBV 相關肝細胞癌易感性升高具有較強相關性，啟動子區GSTP1 和P16 的甲基化能夠顯著升高肝硬化患者發生HBV 相關肝細胞癌的風險。Lv 等[38]Meta 分析選取了3 105 例HCC 患者和808 例非腫瘤患者（包括慢性肝炎和肝硬化），結果顯示HCC 患者的P16 啟動子甲基化發生率顯著高于慢性肝炎患者。此外，大于50 歲的患者P16 啟動子甲基化顯著高于50 歲以下的患者，且HBV 相關HCC患者P16 啟動子甲基化顯著高于病毒陰性的HCC患者。由此可見，P16 甲基化程度與患者年齡大小、是否感染乙型肝炎病毒密切相關。上述結果均提示HBV 感染可誘導P16 基因的高甲基化和異常表達，對HBV 相關HCC 的發生、發展具有促進作用。

3.3 GSTP1 基因的異常甲基化和表達

GSTP1 屬于參與多種致癌物代謝的酶類家族，含有亞基多肽的二聚體酶。GSTP1 是由GSTPi 基因編碼的同工酶，在降低毒性、抗氧化和降低疾病發生率等方面發揮重要的調節作用[39]。GSTP1 通常通過G 位點特異性地與谷胱甘肽（glutathione，GSH）或GSH 類似物結合，并催化谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）氨基酸殘基與GSH 硫醇及H 位點上的傳統親電試劑之間的相互作用[40]。因此，G 位點修飾通常有助于特異性GSTP1抑制劑的產生。國內外大量研究證實，GSTP1 在肺癌、肝癌、結直腸癌、食管癌、膀胱癌、甲狀腺癌等各種類型的腫瘤和癌前病變中表達顯著增高[39，41]。在HBV 相關的HCC 中，Niu 等[42]報道了常見的GSTP1 基因高甲基化和低蛋白表達，DNA 甲基轉移酶抑制劑5-氮雜脫氧胞苷逆轉了HepG2 細胞中GSTP1 的高甲基化。Li 等[28]通過Meta 分析證實了肝癌組織中，GSTP1 基因的甲基化率顯著高于正常組織及肝硬化組織，啟動子區GSTP1 的甲基化可明顯增加肝硬化患者發生HBV 相關HCC 的風險。以上研究證實GSTP1 基因的高甲基化可以促進HBV相關HCC 的發生、發展，并且可能為HCC 分子標志物檢測提供方向。

3.4 SFRP1 和SFRP5 基因的異常甲基化與表達

分泌卷曲相關蛋白是一個分泌糖蛋白家族，是直接結合Wnt 配體和拮抗Wnt 信號通路的胞外信號分子，其表觀遺傳下調已被證明參與了肝癌的發生。Huang 等[43]對105 例肝癌患者和50 例對照組血漿進行比較，發現SFRP1 基因啟動子區的CpG 島高甲基化和LINE1 基因啟動子區的CpG 島的LINE1低甲基化均與HBsAg 及甲胎蛋白（AFP）值相關。Xie 等[32]研究發現乙型肝炎病毒X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）顯 著 降 低 了 肝 癌 細 胞 中SFRP1 和SFRP5 的表達，并且在HBx 表達的肝癌細胞和HBV 相關HCC 組織中，SFRP1 和SFRP5 啟動子都存在高甲基化。他們還發現HBV 相關HCC組織中，SFRP1 和SFRP5 的下調與DNA 甲基轉移酶1（DNMT1）過表達和腫瘤分化不良顯著相關，HBx 可以促進DNMT1 和DNMT3A 與SFRP1 和SFRP5 啟動子的結合，導致SFRP1 和SFRP5 的表觀遺傳沉默。這些結果都證明SFRP1 啟動子的甲基化是HCC 發展過程中常見的表觀遺傳異常變化，對肝癌早期階段的發展可能具有相關性。

3.5 SOCS1 和SOCS3 基因的異常甲基化與表達

細胞因子信號抑制因子家族基因是γ-STAT 信號通路的經典負反饋調節因子[44]。哺乳動物SOCS家族由八個成員組成，包括細胞因子誘導的SH2 含蛋白（CIS）和SOCS1 至SOCS7。據報道，SOCS家族通過抑制酪氨酸激酶/信號傳導及轉錄激活蛋 白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、核 轉 錄 因 子-kappa B（nuclear factor-Kappa B，NF-κB）等 信 號 通 路 及促進p53 等信號通路在抑制腫瘤進展中發揮了重要作用[45]。Zhang 等[46]定量檢測了116 例HBV 相關HCC 患者SOCS1-7 基因的甲基化狀態，結果發現SOCS1 基因在腫瘤組織表現出更高的甲基化強度。此外，在HCC 細胞系中，SOCS1 異位過表達可激活p53 信號通路，所以SOCS1 的基因丟失和表觀遺傳沉默與HBV 相關的HCC 可能有所聯系。Hoan 等[29]的結果顯示與HBV 陰性HCC 腫瘤組織相比，感染HBV 的HCC 腫瘤組織中SOCS3 表達增加。Yuan 等[47]發現HBV 誘導的線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累會抑制SOCS3并持續激活白細胞介素-6/信號轉導及轉錄激活因子3 （interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3）通路。此外，HBV 誘導的ROS 積累被證明促進了鋅指轉錄因子（Snail）的表達，該轉錄因子與SOCS3 啟動子的e-box 結合，介導了DNMT1 和組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 1，HDAC1）與SOCS3 的表觀遺傳沉默。這些結果都提示SOCS1 和SOCS3 的甲基化可能是HBV 相關HCC 發展過程中常見的異常表觀遺傳變化，對患者的生存、預后可能會造成影響。

3.6 LINE-1 基因的異常甲基化與表達

LINE-1 大小為6 kd，是重復DNA 元件的重要組成部分之一，約占人類基因組序列的17%，但由于5'截斷，大部分LINE-1 不活躍[48]。有報道稱LINE-1 低甲基化可作為肝癌診斷和指導治療策略的新標志物，特別是LINE-1 啟動子的低甲基化被發現與腫瘤的進展密切相關[49-50]。Gao 等[51]在臨床隊列中評估了LINE-1 啟動子在每個CpG 位點的甲基化狀態。結果顯示，與HBV 相關肝硬化相比，近90%的HCC 顯示LINE-1 啟動子低甲基化，這也提示LINE-1 啟動子低甲基化（特別是在CpG 位點7 和18）是患者生存時間顯著縮短的原因，與肝癌的不良預后相關。Qiao 等[52]將HBV 相關HCC 患者和慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者進行隊列研究，結果顯示HCC 組LINE-1 甲基化明顯低于CHB組，進一步說明了LINE-1 甲基化水平與HBV 相關HCC 的發生密切相關。以上證據都證明了LINE-1 可以作為新型標志物在肝癌診斷方面具有重要作用。

3.7 其他基因的異常甲基化與表達

鋅指蛋白382（ZNF382）屬于鋅指蛋白家族，ZNF382 基因位于染色體19q13.13，編碼一個約64 kDa 的 鋅 指 蛋 白[53]。Dang 等[54]發 現ZNF382 在HBV 相關HCC 中（相對于HBV 感染的肝硬化組織）常被啟動子甲基化下調，并且ZNF382 的表達下降與早期HCC 患者的低生存率密切相關。另外，有研究證實，HCC 患者Wnt 誘導信號通路蛋白1（Wnt inducible signaling pathway protein 1，WISP1）的甲基化與肝癌患者預后相關[55-57]。同樣，Arzumanyan 等[58]認為HBV 感染可能導致E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-Cad）啟動子區域的高甲基化。Liu 等[59]還指出，HBx 與E-Cad 啟動子的高甲基化有關，并進一步指出，E-Cad 表達的減少可能與細胞質和/或細胞核中-連環蛋白的積累有關，導致細胞遷移增加，從而導致肝癌的發生。此外，Yan等[60]報道稱，非受體酪氨酸蛋白磷酸酶13 型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 13，PTPN13）在HBV 陽性肝細胞癌組織中的表達顯著下降。研究發現DNMT3A 以一種與DNA 甲基化增加相關的表觀遺傳制模式與PTPN13 啟動子（-343～-313 bp）結合，并隨后抑制PTPN13 轉錄。Fan 等[61]通過對HBV 相關HCC 和成對腫瘤周圍肝組織分離的DNA 進行硫酸氫鈉測序，發現STAT3 和八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）通過與轉錄起始位點（transcription start site，TSS）下游位點的染色質重塑蛋白1（Brahma-related gene 1，BRG1）結合，使轉錄因子婆羅雙樹樣基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）基 因在HBV 復制、分化的肝細胞中重新表達?？傊?，ZNF382 等相關抑癌基因的異常甲基化已經被證實對肝癌的進展具有重要作用，但目前對于這些基因進行的相關研究很少，其具體機制尚未得到充分探究，未來對該領域進行更深層次的挖掘將會對肝癌的診斷和治療大有幫助。HBV 相關肝細胞癌中11 個異常甲基化基因的特征見表1。

表1 HBV相關肝細胞癌中11個異常甲基化基因的特征

4 HBV相關肝細胞癌發病機制的研究進展

許多研究表明，HBV 相關的HCC 患者DNA 甲基化水平明顯高于未受感染的肝癌患者，且68%的甲基化基因都與癌癥的發展有關，這表明HBV感染可能影響肝癌組織的基因甲基化[59-61]。但是，HBV 感染如何通過DNA 甲基化誘導HBV 相關的HCC 發生的機制尚未闡明。有研究顯示，HBV 結構蛋白（主要是HBx 蛋白）在HBV 相關HCC 的表觀遺傳學中發揮著重要作用，它通過增加DNMT1 和DNMT3A 的表達，調控癌基因及沉默抑癌基因的表達。HBx 可以促進甲基轉移酶DNMT1 和DNMT3A結合到SFRP1 和SFRP5 的基因啟動子上，沉默SFRP1 和SFRP5，促進腫瘤的發展[32]。另外，抑制DNMT1 可以使Wnt 信號失活，降低Wnt 靶基因C-Myc 和 細 胞 周 期 素D1（cyclin D1，CCND1）的表達水平，從而阻礙HBV 相關HCC 在體內外的生長和侵襲。此外，Yan 等[60]發現HBx 通過上調DNMT3A 的表達并與DNMT3A 相互作用來抑制PTPN13 的表達。DNMT3A 以表觀遺傳學控制的方式與PTPN13 啟動子結合，使PTPN13 甲基化，抑制PTPN13 轉 錄。另 外，HBx 通 過DNMT3A1 和DNMT3A2 的新甲基化，以及通過招募甲基CpG 結合蛋白2（MECP2）到新甲基化的SP1 結合元件來抑制SP1 的結合，特異性地抑制胰島素樣生長因子-3（IGF3）表達[62]。這表明HBx 和DNMT3A的相互作用促進了不同基因組位點的細胞表觀遺傳修飾（通過區域高甲基化或低甲基化）。HBx 還可以通過下調DNMT3B 誘導人類衛星2 重復序列（HSATII）的全局低甲基化。總之，在HBV 感染的HCC 患者中，HBx 的這些特定甲基化異常的發生率與HBx 的表達明顯相關，HBV 的表觀遺傳重塑在HCC 的進展過發病機制程中起著重要的作用。

5 DNA甲基化研究在HCC中的臨床應用

目前，以血清甲胎蛋白為代表的肝癌血清生物標志物在肝癌的早期發現和診斷中發揮著重要作用[63]。然而，其臨床應用一直存在爭議[64]。當AFP值為20 g/L 時，診斷的敏感度在55%～60%，肝癌早期臨床診斷的敏感度較低[65]。此外，患者血清中AFP 升高也可能反映慢性肝炎、肝硬化等疾病，經常導致誤診[66]。DNA 甲基化異常是HCC 表觀遺傳改變的主要介導因子[67]，目前已被證實與多種癌癥的發生、發展相關，某些抑癌基因的異常DNA 甲基化可能是早期診斷疾病的一種潛在的生物標志物[27，68-69]。因此，對正常細胞中的甲基化狀態進行檢測具有重要意義。目前已有許多方法可以用于分析腫瘤組織或健康組織的DNA 甲基化水平，包括甲基化特異性PCR（MS-PCR）、亞硫酸氫鹽、熒光定量法（Methylight）等[70]。Pasha 等[71]發現在HCC 診斷中，聯合檢測AFP 和RASSF1A 基因甲基化狀態及聯合檢測AFP 和SOCS1 基因甲基化狀態比單獨檢測AFP 更有益處。RASSF1A 啟動子甲基化與血清AFP 聯合使用，可作為HCC 診斷和預后的高效生物標志物。Chen 等[57]研究發現與單獨使用AFP 或WISP1 甲基化狀態相比，WISP1 啟動子甲基化狀態與AFP 聯合檢測顯著提高了區分HCC與CHB 的診斷能力。由此可見，WISP1 基因啟動子的低甲基化可作為檢測HBV 相關HCC 的非侵入性生物標志物。異?；騿幼映谆驯惶岢鲎鳛樵\斷實體腫瘤的一種有效手段。因此，使用強有力的指標對慢性HBV 感染患者進行定期評估，將有助于提高肝癌診斷和治療的及時性。

6 總結與展望

HBV 感染到肝癌細胞出現涉及腫瘤微環境和遺傳等多方面的因素相互作用，多種機制共同參與了這一進程，而在這些HBV 相關肝細胞癌發病機制中，DNA 甲基化發揮著具有其典型特色的關鍵作用。更重要的是，隨著臨床方面現有的腫瘤治療手段出現越來越多的治療抵抗現象，預示著僅僅依靠現有的途徑無法達到顯著的治療效果，迫使大家必須去尋求更為高效的、特異性的治療靶點。因此，尋找DNA 甲基化致使抑癌基因沉默的原因，深入研究DNA 甲基化在HBV 相關HCC 發病過程中的作用，對于闡明HBV 相關HCC 的發病機制具有重要意義。DNA 甲基化有可能是腫瘤早期診斷的一個非常有前景的指標，而針對甲基化治療的DNA 甲基化抑制劑則有較強的特異性，仍需更深入的研究。