HOXD3 在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義*

陳小友 李隆玉 江維#

（1 南昌大學2016 級研究生 江西南昌 330006；2 江西省南昌市經開區樂化中心衛生院 南昌 330114；3 江西省婦幼保健院 南昌 330006）

宮頸癌（Cervical Cancer, CC）是世界范圍內嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，是唯一可以通過三級預防措施消除的惡性腫瘤[1]。2018 年全球范圍有569 847 新發病例，311 365 死亡病例，全球宮頸癌的發病率和病死率均居第四位[2]。我國每年有超過13 萬新發病例，約6 萬人死于宮頸癌。國際婦產科聯盟（FIGO）分期為ⅠA～ⅡA 期的早期宮頸癌五年生存率（OS）可以達到80%～90%，ⅡB 期60%～70%，Ⅲ期約40%，ⅣA 期只有20%。宮頸癌以直接蔓延、淋巴轉移及血行轉移為主，淋巴結轉移是宮頸癌最為常見的轉移途徑之一，也是決定宮頸癌預后的一個獨立危險因素。有資料顯示，未發生淋巴結轉移者術后五年生存率為80%～100%，有淋巴結轉移者五年生存率降至約47%[3]。InoueInoue 和Morita的研究也發現轉移淋巴結的多少與ⅢC1 期患者預后有密切關系，轉移淋巴結1 個、轉移淋巴結2～3個、轉移淋巴結≥4 個的ⅢC1 期患者5 年OS 分別是81%、41%和23%[4]。手術和靶向治療CC 有一定的發展，但是晚期CC 患者生存率不高，因此如何尋找治療宮頸癌的新靶點，減少治療后的復發和轉移，改善存活率，具有重要意義。

近年來，研究者開始著重關注宮頸癌發生發展中的基因突變和蛋白表達，同源盒（Homebox,HOX）基因從胚胎發育到癌變的全過程中發揮著多類作用。HOX 基因最早于1915 年由卡耳文·布里吉斯（Calvin Bridges）在果蠅中發現[5]，HOX 基因能使果蠅按照正常的空間順序進行肢體發育，同時調控其形態的改變，避免畸變的發生[6]。HOX 基因編碼轉錄因子家族是一種在進化上高度保守的基因家族，它廣泛存在于真核細胞中，并主要參與動物肢體和形態發育等方面的調控[7]。此外，HOX 基因作為細胞增殖及分化的主控基因，其表達異常被證明與多種腫瘤（如白血病、前列腺癌、腎癌、膠質細胞瘤等）的發生、發展密切相關[8～9]。

HOXD3 屬于HOX 基因家族的一員，其表達產物為重要的轉錄因子，在調控細胞增殖、凋亡、分化及腫瘤細胞侵襲轉移等方面發揮重要作用，現已知其調控的基因包括黏附分子、生長因子和胞外蛋白等。目前研究表明HOXD3 具有多種生物學功能，并與多種腫瘤的進展有關，如在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌等多種腫瘤中異常表達[10]，且與腫瘤的預后及分期密切相關。HOXD3 基因可以通過調節不同的靶點，發揮對腫瘤發生發展的作用。本研究探討HOXD3 在宮頸癌組織中的表達水平及臨床意義，提供實驗依據，采取針對性的干預措施，提高生存率至關重要。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集并篩選77 例宮頸組織石蠟標本，于2020 年10 月至2022 年10 月病理確診的33 例宮頸癌早期（ⅠB1～ⅠB2 期）、10 例局部晚期癌（ⅠB3 期）、20 例中晚期癌（Ⅱ～Ⅲ期）及5 例正常宮頸患者、9 例宮頸上皮內瘤變（CIN）為研究對象。本研究采用的宮頸癌組織、癌旁組織（與病灶之間的距離大于3 cm）標本由江西省婦幼保健院腫瘤科及病理科提供。研究中所需要的組織標本和臨床病理資料，都是經本院倫理委員會索取，并征得患者知情同意。按FIGO 2018 標準進行分期。選擇的癌組織及癌旁組織均經過有一定資質的病理科主任醫師確定。在本研究中使用的患者病例資料均真實、完整。記錄患者的一般臨床病理資料：年齡、病理類型。

1.2 納入標準 （1）除手術外，患者未經歷免疫治療、化學治療或放射性治療；（2）根據病理結果進行補充放化療；（3）納入患者僅包括病理結果顯示為宮頸鱗狀細胞癌的患者；（4）其他部位沒有原發的第二腫瘤；（5）患者沒有嚴重糖尿病、高血壓或嚴重心臟病史。

1.3 主要試劑 HOXD3 兔多克隆抗體購自美國賽默飛公司；于北京中杉金橋生物技術公司購買兔二步法檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗、免疫組化技術（IHC）抗體稀釋液。武漢博士德生物公司購買即用型正常山羊血清。

1.4 免疫組化步驟及結果判定方法 IHC 又名免疫細胞化學，其原理是用帶顯色劑標志的特異性抗體與組織細胞原位發生抗原抗體反應及組織化學呈色反應來達到定性，定位目的、對相應的抗原物質進行了定量測定。該技術將免疫反應特異性與組織化學可見性巧妙融合，并且借助于顯微鏡可對多種抗原物質進行細胞及亞細胞層面的檢測。

1.4.1 免疫組織化學方法 檢測宮頸鱗狀細胞癌患者石蠟標本中HOXD3 蛋白的表達情況。（1）將載玻片進行預處理：先把玻片事先放入濃酸溶液中、酒精中，再充分洗滌，干燥。其次把玻片泡在稀釋多聚-L- 賴氨酸溶液10 s 左右，再拿出來，放入烤箱（45℃）晾干，避免組織切片脫落。（2）組織切片：在切片機上取石蠟包埋標本，切取厚度為4～5 μm 的組織，與玻片密貼。（3）撈取切片：待切組織樣本勻速攤開，撈取攤開的切片，鋪上載玻片，再把架子放在溫箱內干燥，設定溫度30℃。（4）脫蠟：干燥切片按順序置于乙醇、二甲苯液濃度不等，實施梯度脫水脫蠟，每試劑脫蠟10 min，再經過雙蒸水處理及磷酸緩沖鹽溶液（PBS）處理。（5）修復抗原：于檸檬酸中高溫高壓修復。（6）增加一抗，二抗：把HOXD3 抗體按1:100 的比例稀釋，慢慢地將50 μl 一抗工作液滴到玻片上，保證充分浸潤組織。把載玻片放在4℃的濕盒內孵化一晚，并設陰性對照，以血清替代一抗。注意不要在濕盒中加水。次日用PBS 液清洗載玻片3次，每次5 min。利用濾紙將組織周圍的液體吸出，滴100 μl 反應增強液于標本玻片上用37℃濕盒孵化20 min。然后滴100 μl 增強酶山羊/ 小鼠/ 兔IgG 聚合物37℃濕盒內孵化20 min。（7）DAB 顯色；37℃室溫滴加顯色劑，計時4～5 min，呈現棕黃色沉淀物，說明有顯色反應。隨即以蒸餾水清洗玻片，結束顯色反應，最后置于氨水中，組織返藍，然后用自來水清洗2 min。（8）蘇木素伊紅染色封片：二甲苯中透明。透明化處理完成之后，將切片烘干，再用中性樹膠進行封片，將其置于顯微鏡下進行觀察。

1.4.2 顯微鏡圖像采集及結果判定 HOXD3 主要在胞漿著色，隨著臨床病理分級不同，細胞的染色強度也不同，陽性染色呈棕褐色、棕黃色、淡棕黃色；采用半定量方法，由2 位經驗豐富的病理科醫師進行雙盲閱片，根據細胞的染色強度及陽性染色面積進行判定。染色強度分數標準：無色為0 分，淡棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性胞漿面積：隨機選取5 個高倍視野（×400）對陽性腫瘤胞漿面積進行統計，計算陽性細胞染色所占百分比：陽性面積≤10%，為1 分，10%～50%為2 分，50%～75%為3 分，＞75%為4 分。將上述兩分相加，＜2 分為（－），2～3 分為（1+），4～5 分為（2+），＞6 分為（3+）。依據HOXD3 免疫組化結果：0～1+ 為不表達（陰性），2+～3+為表達（陽性）。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用Spearman 相關分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義，最后使用Canvas 12 和Adobe Photoshop 2022 進行照片排版處理。

2 結果

2.1 免疫組化檢測HOXD3 在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達情況 HOXD3 在宮頸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，在高-中-低分化宮頸癌組織中陽性率顯著高于宮頸正常組織，隨著CIN 病情進展，HOXD3 的表達率逐漸升高，顏色逐漸加深，呈明顯的遞增趨勢（P=0.001），在中晚期（Ⅱ～Ⅲ期）表達顯著增強（P＜0.05），陽性染色趨勢主要呈淡棕黃色、棕黃色、棕褐色，差異有統計學意義（χ2=24.595，P=0.001）。見圖1、圖2、表1。

表1 HOXD3 與FIGO2018 CC 臨床病理分期之間的關系[例（%）]

圖1 HOXD3 蛋白在各級組織中的表達情況（×400）

圖2 HOXD3 在臨床病理分期與各組之間的關系

2.2 HOXD3 基因表達與患者各年齡段的相關性不同臨床分析與正常組織的HOXD3 基因表達與患者各年齡段無顯著相關性（χ2=18.838，P＞0.05）。見圖3、表2。

表2 HOXD3 與各年齡段之間的關系[例（%）]

圖3 HOXD3 在各年齡段之間的關系

3 討論

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，導致患者病死率增加。全球宮頸癌的發病率和病死率均居第四，我國每年有超過13 萬新發病例，6 萬人死于宮頸癌。進展期宮頸癌患者的生存率并不高，轉移和復發是其主要死因。因此，積極探索宮頸癌細胞增殖侵襲遷移的研究，對宮頸癌的治療有重大意義。早期宮頸癌患者可行手術治療，治愈率較高；而化療、放療、手術和靶向治療CC 取得了進展，但晚期CC 患者生存率并不高。

近年來的研究表明，多種HOX 基因與實體腫瘤的發生發展密切相關，其中人類HOX 基因有39個基因成員組成，分布在4 個保守基因簇中，HOXD包含9 個成員，分別為HOXD1、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOXD11、HOXD12 和HOXD13[11]。HOXD3 基因屬于HOX 基因家族的第三旁系成員，是一種轉錄因子和信號傳導蛋白。該蛋白質參與生物化學反應或細胞信號傳遞中，調控基因表達、細胞增殖、分化等生理過程。

在本部分研究中，通過免疫組化檢測對77 例宮頸石蠟標本中宮頸癌組織和正常宮頸組織中HOXD3 的表達水平進行研究，發現HOXD3 在各組中的表達水平存在顯著差異。隨著CIN 病情的惡化，HOXD3 的高表達率逐漸升高，呈現遞增趨勢，特別是在中晚期（Ⅱ～Ⅲ期）表達顯著增強。此外，隨著臨床病理分級的提高，HOXD3 的表達水平也相應增加，顏色更深，陽性染色呈淡棕黃色、棕黃色、棕褐色。然而，HOXD3 的表達與患者各年齡段之間并無顯著相關性。研究表明，HOXD3 在促癌基因中發揮作用。在結腸癌癌旁組織中，HOXD3 基因表達水平較低，而在癌組織中表達水平較高。此外，HOXD3基因表達水平與腫瘤TNM 臨床分期、腫瘤浸潤深度呈正相關關系[12]。研究表明，HOXD3 mRNA 在胃癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織（t=10.48，P＜0.01）[13]，與正常乳腺組織相比，HOXD3 在乳腺癌組織中過表達[14]。CHEN 等[15]的研究發現，結直腸癌組織中HOXD3 的高表達能夠在體外上調結直腸癌細胞中的HOXD3 表達，明顯促進細胞周期進程和增殖，并且降低細胞凋亡水平，這表明HOXD3 具有促進結直腸癌細胞增殖的作用，Litovkin 等[16]發現前列腺癌組織內HOXD3 高度甲基化，并與前列腺癌的高危風險明顯相關。Miyazaki 等[17]的研究表明，HOXD3 可以促進肺癌細胞A549 中轉化生長因子-β（TGF-β） 的表達，從而上調基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達，這表明HOXD3 可能具有促進肺癌轉移的作用。此外，研究人員還分析了HOX 基因在人類肺小細胞癌移植小鼠中的表達，并指出HOXD3 在一些原發性和轉移性腫瘤中表達，而在正常組織中不表達或表達水平較低[18]。

綜上所述，本研究中HOXD3 在CC 中表達水平的改變與HOXD3 在乳腺癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌等研究結果相一致。提示HOXD3 在CC 中表達可能是一種促癌基因。綜合實驗結果，可以得出結論：HOXD3 在宮頸癌組織中的表達顯著增加，并與宮頸癌的FIGO 分期相關，推測HOXD3基因與宮頸癌的發生和發展密切相關，可能在促進宮頸癌的發生和發展中發揮一定作用，因此可以作為評估宮頸癌惡性程度的重要參考指標。但是HOXD3 在宮頸癌組織中異常表達的具體機制以及其對宮頸癌發生發展過程的具體影響和作用機制等問題還需要進一步深入研究。未來，HOXD3 有望作為一種監測宮頸癌進展和新治療方法敏感性的生物標記物。

本研究存在一定的局限性，因此需要對結果進行謹慎解釋。為了更好地服務于病患，未來的研究應該努力擴大研究樣本的規模并改進研究方法，以提高結果的準確性和可靠性，為疾病治療提供依據。