宏基因組二代測序診斷的鸚鵡熱衣原體肺炎16 例臨床分析

鄭 君，龐迎晨，曾超，劉湘瀘，徐平*（.北京大學(xué)深圳醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 58036；2.南山醫(yī)療集團(tuán)總部深圳灣社康中心，廣東深圳，58052）

目前，肺部感染病原體復(fù)雜程度越來越高，傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法在敏感性、特異性、時效性、信息量等方面存在局限，且對于未知或者罕見的病原微生物，無法快速識別。宏基因組二代測序技術(shù)（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序，能夠快速、客觀檢測臨床樣本中的較多病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。鸚鵡熱衣原體是一種革蘭陰性需氧細(xì)胞內(nèi)寄生的病原菌，鳥類是主要宿主。鸚鵡熱衣原體肺炎是由鸚鵡熱衣原體引起的肺部感染，是社區(qū)獲得性肺炎的罕見病因，以往由于缺乏快速準(zhǔn)確的診斷方法，臨床確診的病例很少，發(fā)病率<1%，重癥患者病死率高。隨著 mNGS 逐漸應(yīng)用于臨床，越來越多的鸚鵡熱衣原體肺炎被診斷。現(xiàn)收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院2020 年9月-2022 年7 月收治的16 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者，分析其臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)表現(xiàn)特點(diǎn)以及治療轉(zhuǎn)歸，了解應(yīng)用支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）mNGS 對鸚鵡熱衣原體肺炎診斷的臨床意義，從而提高對該病的認(rèn)識及療效。

1 資料和方法

1.1 病例

收集我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的鸚鵡熱衣原體肺炎患者16 例，均在支氣管鏡下采集患者BALF，行mNGS 檢測，檢出鸚鵡熱衣原體。

1.2 方法

1.2.1 BALF 的收集及處理 根據(jù)患者胸部CT 確定病變位置，行支氣管鏡檢查并收集BALF，支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）檢查參照相關(guān)專家共識[1]，具體流程為：（1）部位選擇，以病變段優(yōu)先的原則，若雙肺存在彌漫性病變的患者，優(yōu)先選擇右肺中葉或左上葉舌段；（2）注入生理鹽水，把支氣管鏡嵌頓在灌洗部位的支氣管段或亞段開口處，注入室溫?zé)o菌的生理鹽水，總量為40～60 mL；（3）負(fù)壓吸引，注入生理鹽水后10～15 s，負(fù)壓吸引獲取支氣管肺泡灌洗液，總回收率＞50%。取肺泡灌洗液2 mL 送檢mNGS 檢測，其余BALF 用于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)及送其他檢查。

1.2.2 mNGS 檢測 取600 μL 患者的BALF，送至華大基因測序儀平臺（深圳華大基因股份有限公司）進(jìn)行檢測，通過BWA（BWA：http://bio-bwa.sourceforge.net/）比對將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度reads 后與專用細(xì)菌（6 350 種）、真菌（1 064 種）、病毒（4 945 種）、寄生蟲（234 種）4 個微生物大數(shù)據(jù)庫比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

16 例中男5 例（31.3%），女11 例（68.7%），有禽類接觸流行病學(xué)史9 例（56.3%）。臨床癥狀主要有：發(fā)熱14 例（87.5%），咳嗽咳痰12 例（75.0%），胸痛5 例（31.3%），呼吸困難5 例（31.3%），腹瀉4 例（25.0%），咯血2 例（12.5%）、嗜睡2 例（12.5%），神志不清2 例（12.5%），其中出現(xiàn)呼吸衰竭2 例（12.5%）。

2.2 mNGS 結(jié)果

16 例患者BALF mNGS 均檢測出鸚鵡熱衣原體，序列數(shù)為43～3 254。

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

3 例白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）輕度升高，12 例（75.0%）中性粒細(xì)胞百分比升高，8 例（50.0%）高敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）明顯升高，16 例（100.0%）降鈣素原（PCT）升高，6 例（37.5%）肌酶增高，2 例（12.5%）動脈血氧分壓（PaO2）<60 mmHg，5 例（31.3%）氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）<300。

2.4 影像學(xué)檢查

所有患者均有胸部影像學(xué)改變，表現(xiàn)為肺部實(shí)變、滲出、結(jié)節(jié)。16 例均有肺實(shí)變，15 例（93.8%）為單肺大葉性實(shí)變影，1 例為雙肺實(shí)變（6.3%），1 例合并肺部結(jié)節(jié)改變（6.3%）。3 例合并少量胸腔積液（18.8%）。胸片或CT 在治療后1～2 周均有吸收。

2.5 治療及轉(zhuǎn)歸

16 例患者中：（1）3 例初始治療使用莫西沙星針劑單藥治療，2～3 d 后體溫及臨床癥狀恢復(fù)，確診鸚鵡熱衣原體肺炎后，聯(lián)合米諾環(huán)素治療，療程共14 d，10～14 d 時復(fù)查胸部影像學(xué)好轉(zhuǎn)；（2）3 例初始治療方案為莫西沙星聯(lián)用β 內(nèi)酰胺類抗生素，2～3 d 后體溫恢復(fù)正常，確診后予莫西沙星單藥治療，療程14 d；（3）3 例開始使用β 內(nèi)酰胺類抗生素3～5 d 無效，改用莫西沙星后癥狀緩解；（4）2 例予β 內(nèi)酰胺類抗生素?zé)o效，3～6 d 后確診，調(diào)整治療方案為莫西沙星聯(lián)合多西環(huán)素，均在1～2 d 后體溫及臨床癥狀恢復(fù)；（5）2 例重癥患者，1 例初始使用碳青霉烯類抗生素治療無效，2～3 d 后確診后改為莫西沙星聯(lián)合米諾環(huán)素治療，患者2 d 后癥狀體溫緩解；另1 例重癥患者，結(jié)合患者癥狀、體征、化驗(yàn)及影像學(xué)結(jié)果，不排除非典型病原體感染可能，初始經(jīng)驗(yàn)性使用頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)合米諾環(huán)素治療，體溫1 d 后恢復(fù)正常，2～3 d 后神志好轉(zhuǎn)。以上患者在體溫等癥狀恢復(fù)7 d 后，復(fù)查胸片或CT 均好轉(zhuǎn)，隨訪4 周復(fù)查，病灶完全吸收。16 例均好轉(zhuǎn)出院，住院時間7～13 d。

3 討論

近年來，鸚鵡熱衣原體肺炎檢出呈增多趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，約有1%的社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）是由鸚鵡熱衣原體引起的[2-3]。鸚鵡熱是一種人畜共患病，所有鳥類均易感，寵物鳥和家禽最常將鸚鵡熱衣原體傳染給人類。禽類加工者和鳥類飼養(yǎng)員暴露于病原體的機(jī)會最多，家禽是我國最重要的感染源。而且，人類可通過直接接觸疫鳥或吸入疫鳥鼻腔分泌物的氣溶膠和糞便或羽毛的粉塵而感染鸚鵡熱衣原體，但未證實(shí)人際傳播[4]。該病的發(fā)病率主要由流行病學(xué)環(huán)境決定[5]。

鸚鵡熱衣原體肺炎發(fā)病的潛伏期通常為5～14 d，甚至更長，其癥狀類似于流感，缺乏特異性，臨床表現(xiàn)多為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肌肉酸痛、劇烈頭痛和胃腸道癥狀。疾病的嚴(yán)重程度從輕微的非特異性疾病到伴有嚴(yán)重肺炎的全身性疾病，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，其中血清CRP、PCT 對重癥肺炎患者的預(yù)后有較高的預(yù)測價值[6]。有文獻(xiàn)報道，135 例鸚鵡熱衣原體肺炎的患者中，100%的患者有發(fā)熱，82% 的患者有咳嗽[7]，本文結(jié)果與其一致。

鸚鵡熱衣原體肺炎在影像學(xué)上無特異性，表現(xiàn)為自肺門向外的楔形斑片影，密度不均，嚴(yán)重者累及整個肺葉，HRCT 顯示部分病變區(qū)呈實(shí)變結(jié)節(jié)與磨玻璃樣變，以磨玻璃樣變?yōu)橹鱗8]，實(shí)變區(qū)有支氣管氣像，實(shí)變以外側(cè)肺野較明顯。本研究中，胸部CT 均見炎癥改變，大部分呈單葉實(shí)變，少見雙葉實(shí)變及胸腔積液；患者血白細(xì)胞基本正常，hs-CRP、血沉明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)所有患者PCT 均升高，75%的患者中性粒細(xì)胞百分比增高。本研究還發(fā)現(xiàn)6 例患者肌酶增高，我們認(rèn)為，對肌酶增高合并肺炎的患者應(yīng)警惕鸚鵡熱衣原體肺炎的可能。

由于鸚鵡熱衣原體肺炎臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變無特異性，流行病學(xué)史存在不確定性，病原體培養(yǎng)困難，血清學(xué)存在時效性及特異性，一直以來其診斷較為困難，目前的血清學(xué)檢測金標(biāo)準(zhǔn)是MIF 試驗(yàn)，IgM 抗體滴度≥1∶16 被認(rèn)為是衣原體暴露的重要證據(jù)，檢測雙份血清抗體滴度增加4 倍或以上并有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)可用于診斷鸚鵡熱衣原體感染[9]，因需要對比患者疾病急性期和恢復(fù)期的血清，僅適用于回顧性診斷，對治療指導(dǎo)價值有限。宏基因組二代測序技術(shù)不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序，然后與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀的檢測臨床樣本中的較多病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴(kuò)增[10-14]，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷，為疑難危重癥及罕見病原微生物感染的診斷提供了有效的技術(shù)手段[15]，且在理論上能無偏倚地檢測出所有潛在病原體，對于早期診斷疑難感染病例具有重大意義[16]。BALF 是經(jīng)支氣管鏡插入病變肺段或支氣管下段，經(jīng)電子支氣管鏡向局部支氣管肺泡中灌注生理鹽水，抽吸獲取肺泡表面襯液，并且直接收集感染部位灌洗液，可以提高檢測檢出率與準(zhǔn)確率，減少口腔、鼻咽微生物污染，其具有較好的安全性和敏感性，可以作為重癥肺炎及早明確病原學(xué)的方法[17]，有助于臨床診斷及制定治療方案，對于疑難危重癥患者的救治有重要作用。

鸚鵡熱衣原體是嚴(yán)格致病菌，正常人氣道并不存在，檢出有臨床意義。本研究中16 例均通過宏基因組二代測序技術(shù)快速、準(zhǔn)確地找到鸚鵡熱衣原體，進(jìn)一步結(jié)合流行病學(xué)、癥狀、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)果分析，明確鸚鵡熱衣原體肺炎診斷，并根據(jù)病原學(xué)及時調(diào)整了抗生素的治療后，療效明顯。鸚鵡熱衣原體肺炎推薦使用的抗生素有四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類，磺胺類藥物一般無效。鸚鵡熱衣原體肺炎的一線用藥為四環(huán)素類[18-19]，患者經(jīng)四環(huán)素類抗生素抗感染治療14 d 后，病灶基本可吸收，為避免復(fù)發(fā)，我們建議四環(huán)素類藥物治療的時間至少應(yīng)有21 d。本文15 例使用喹諾酮類藥物單用或聯(lián)合四環(huán)素類藥物，治療有效，1例初始單用米諾環(huán)素治療后癥狀好轉(zhuǎn)，單藥治療維持有效。在本文的患者中，喹諾酮類藥物療程20～27 d，四環(huán)素類藥物療程14～26 d，2 周復(fù)查胸部CT 提示病灶明顯吸收，4 周基本完全吸收，提示喹諾酮類藥物與四環(huán)素藥物均有效。

鸚鵡熱衣原體肺炎既往被認(rèn)為是少見病，但是現(xiàn)在隨著mNGS 技術(shù)的發(fā)展，檢出率不斷增加。我們推測，現(xiàn)在的鸚鵡熱衣原體肺炎并不少見，但因?yàn)槠渑R床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)缺乏特異性，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法時效性較差，鸚鵡熱容易被誤診和漏診。因此在臨床工作中，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)保持對鸚鵡熱肺炎的警惕性，需仔細(xì)詢問病史以發(fā)現(xiàn)可能的線索，對于病原不明的肺炎尤其是重癥肺炎患者，如果白細(xì)胞計(jì)數(shù)不高，中性粒細(xì)胞及hs-CRP 增高，有不明原因的肌酶增高，應(yīng)盡早行進(jìn)行 mNGS 檢查，以便早期明確診斷，避免誤診、漏診，減少非必要抗生素特別是超廣譜抗生素的使用和藥物不良反應(yīng)，提高治愈率，改善預(yù)后。