豬場PRRSV攻毒試驗探索及陽性血清的制備

施瑩　謝孟娟

摘要：良圻原種豬場長期采用血清馴化的方式進行豬藍耳病的防控，并摸索出一定的經驗，在此基礎上開展本試驗。近期，經PRRSV陽性樣品采集、PRRSV測序和同源性對比確認豬場可能存在2種以上的PRRSV毒株，為了制備優勢毒株血清，本試驗對雙陰性豬只（35日齡）進行PRRSV攻毒試驗，在對PRRSV攻毒試驗進行探索的同時，為后期血清馴化提供技術支持。

關鍵詞：PRRSV；攻毒試驗；陽性血清；制備

豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），是由豬藍耳病病毒（PRRSV）引起的一種高接觸性傳染病，其感染性無品種、年齡和用途的差異，對所有豬均能造成不同程度的危害，為豬場的發展帶來直接和間接經濟損失的同時，還致使豬場長期發展受到制約。多年來，本豬場也一直采用血清馴化的方式來控制豬藍耳病，取得了較好的防控效果。一是通過人為干預控制豬群的感染時間，切實做好監控和應對措施，盡可能使豬群保持一致的狀態。二是選用本場的病毒株來進行血清馴化，借助馴化血清的單一性獲得一致性的抗體，提升豬群的免疫力，提升母豬的繁殖性能和生產性能，為豬場長期健康發展夯實基礎。

1 試驗目的

1.1 PRRSV攻毒試驗

經過豬場血清馴化的寶貴經驗，現已掌握豬藍耳病樣本Ct值在23左右的時候，直接將血清稀釋500倍進行血清馴化效果最佳。為進一步驗證是否CT值為23的血清稀釋后攻毒效果更佳，并更明確PRRSV攻毒試驗的要點，特開展此試驗，用兩個不同Ct值的血清對抗原抗體雙陰性豬（35日齡）進行攻毒，跟蹤攻毒后臨床癥狀和抗原抗體的變化情況，為豬場血清馴化提供技術指導和數據支持。

1.2 陽性血清的制備

近期，本豬場血清馴化不穩定，為了確認豬場存在的PRRSV毒株種類，采集陽性樣品進行測序、同源性比對，發現豬場可能存在2種以上的PRRSV毒株。為滿足血清馴化的血清要求，決定重新進行攻毒并制備血清。選用PRRSV雙陰性豬進行PRRSV攻毒試驗，對攻毒前后的PRRSV進行測序和基因比對，確定同源性一致、Ct值滿足要求后殺豬取血制備血清，為后期豬場的血清馴化提供安全血清。

2 試驗材料

豬場制備的PRRSV血清，選取2022年9月29日與本豬場優勢毒株序列一致的流產母豬耳號2B26-Y333702血清（CT值19.92），公司內部保存；PRRS抗原抗體雙陰豬，35日齡，來源于本豬場；抗原檢測試劑盒（ANIMAL-20220919），抗體檢測試劑盒（ID.Vet-I0701，IDEXX-EU610）；儀器ABI 7500、ABI QuantsudioTM5、BioTek 50TS、BioTek酶標儀ELX800。

3 試驗方法

3.1 豬場毒株種類鑒定

采集6份陽性樣品進行PCR擴增后送測序公司進行測序，用DNAstar lasergene與本豬場優勢毒株進行同源性對比。

3.2 PRRSV攻毒方法

每只豬編號、對應的血清及攻毒時間如表1，另設置一只豬（FD013861）不進行攻毒，與FD013890、FD013899共同飼喂，觀察其能否被自然感染，作為血清制備的備選。

3.3 采血檢測

攻毒后每天進行采血和檢測，時間為12d，檢測Ct值，以此判斷抗原結果；檢測抗體S/P值，以此判斷抗體結果。需要注意，由于本試驗進行兩次攻毒，第二次攻毒（第3d）前要先采血測定后再進行攻毒，以免攻毒影響當日檢測結果。

3.4 攻毒前后同源性對比

對兩只試驗豬的陽性樣品進行PCR擴增后送測序公司進行測序，用DNAstar lasergene與本豬場優勢毒株進行同源性對比。

4 結果和分析

4.1 豬場毒株鑒定結果

本場6個樣品測序后，跟現用馴化血清進行兩兩相互比對，同源性從83.0%～100%不等（見圖1），整體分為兩大類，表明豬場內至少存在2種不同PRRSV，為防沿用自存的血清導致血清馴化失敗，豬場決定重新制備血清。

4.2 攻毒前豬只PRRS監測情況

PRRS雙陰豬檢測情況見表2，通過檢測抗原抗體雙陰性，證明試驗動物符合PRRS攻毒要求；通過檢測證明豬只不存在非瘟、PED、TGE、PDCV、豬瘟、豬偽狂犬等影響PRRS血清制備的疾病因素，證明試驗動物符合制備血清的要求。

4.3 攻毒后PRRS抗原監測情況

PRRS雙陰性豬攻毒后Ct值檢測結果及PRRS抗原結果見表3。本試驗中通過試劑盒Ct值的測定對抗原結果進行判定，結合本試驗檢測結果，Ct值≤38或有明顯的指數增長期判定為陽性；Ct值＞38的樣本建議重做，重做后無CT值判定為陰性，否則判為陽性。由表3分析，PRRSV攻毒后，FD013890第4d開始呈抗原陽性；FD013899從第2d起即開始呈現抗原陽性；陰性對照則截至12d抗原皆為陰性。

4.4 攻毒后PRRS抗體監測情況

PRRS雙陰性豬攻毒后PRRS抗體檢測情況見表4。由表4分析，PRRSV攻毒后，FD013890第12天開始呈抗體陽性；FD013899從第6d起即開始呈現抗體陽性；陰性對照至試驗結束未呈現抗體陽性。

4.5 攻毒后臨床癥狀

FD013890攻毒后第3d開始出現嗜睡、喘氣異常等癥狀并伴隨體溫升高至40℃以上；FD013899攻毒后第5d開始出現嗜睡、喘氣異常等癥狀并伴隨體溫升高至40℃以上；陰性對照未出現臨床癥狀。

4.6 攻毒前后同源性比對

第12d殺豬取血，對兩只攻毒豬的血清進行測序后，和本豬場優勢毒株兩兩相互比對，同源99.9%、100%，表明攻毒前后同源性一致，可以用于血清制備。

4.7 血清制備

第12d，以Ct值為判定依據（表3），Ct值＜23的豬只作為血清制備的選擇，確定攻毒豬FD013899用來制備血清，按照血清制備方法制備，血清制備量及處理保存方式見表5。

5 討論

5.1 PRRS抗原方面

通過本試驗發現，攻毒豬13890和13899抗原轉陽均早于抗體轉陽；豬只13899攻毒后較13890攻毒后抗原、抗體轉陽更早；豬只13899抗原與抗體轉陽間隔時間更短。證明，CT值23左右的血清用于本場血清馴化，豬只更早感染，可以縮短感染時間，降低生產成本，提高血清馴化的效率。陰性對照豬FD013861抗原至試驗結束仍未轉陽，分析原因可能是豬藍耳病的潛伏期差異較大，引入感染后，最短3d，最長能達到37d，并且感染時間也受病毒株影響，此毒株可能毒性較弱，且健康豬只抵抗力強，因此自然感染時間相對長甚至不感染。在后期試驗中可以延長試驗周期或增加平行樣品數量，以此增加檢測數據量，通過分析提高可信度。

5.2 PRRS抗體方面

攻毒豬13890抗體轉陽較抗原轉陽延后8d，13899抗體轉陽較抗原轉陽延后4d，鑒于抗體轉陽較抗原轉陽的滯后性，在臨床中抗原檢測更可靠，并常將抗體檢測作為是否感染過PRRSV的依據。在臨床檢測中，要綜合判斷，不要只依賴于單一的檢測手段來判定豬只的感染狀態，以免造成誤判。

5.3 PRRSV同源性檢測的意義

一般來說，PRRSV序列分析同源性越高，變異越小，對豬場造成的危害相對較小。為了提高防控效果，應該對豬場PRRSV的種類有一個清晰的認識，加強對馴化血清的管理，對病料進行測序分析，選擇優勢毒株，篩選同源性高的血清進行血清馴化，保證馴化效果。

5.4 血清馴化的優點和注意事項

血清馴化選用本豬場的毒株，防控時具有很好的交叉保護能力，能夠有效防控；對于豬藍耳病毒活躍的母豬場，血清馴化可以快速控制藍耳病，及時清除豬群的病毒量，大大降低損失；血清馴化后的豬場能夠維持較長時間的穩定性，降低豬藍耳病的管控難度；血清馴化成本低，對于豬場效益提升和其他疾病的防控有很大的借鑒作用。

參考文獻

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