miR-101對乳腺癌患者的診斷及對乳腺癌細胞自噬和凋亡的影響

宋雅琪, 張志生, 孔令霞, 劉進宇

(河北北方學院附屬第一醫院乳腺外科, 河北 張家口 075000)

乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一,每年全球大約有130萬新增乳腺癌患者,其中50萬死于乳腺癌[1]。盡管乳腺癌的篩查和治療方法在近年來有所改進,但該疾病的分子發病機制仍不完全清楚,乳腺癌仍然是一項重要的公共衛生挑戰。微小RNA(miRNAs或miRs)是小的非編碼RNA分子,可通過靶向3’-非翻譯區(3’-UTR)負調節其靶mRNA的穩定性或翻譯效率來調節基因表達。在人類基因組中超過10%的蛋白質編碼mRNA可能是miRNA的保守靶標[2],miRNAs可以作為原癌基因或抑癌基因發揮作用[3],在細胞增殖、凋亡、細胞周期、分化、遷移等生命活動中起著重要作用。這表明miRNA在人類的生物學過程中具有重要作用。Iorio等[4]鑒定了29種miRNAs,與正常乳腺組織相比,它們在乳腺癌中的表達明顯失調,包括miR-10、miR-101b和miR-125b,它們在乳腺癌中下調,以及miR-145和miR-21,它們在乳腺癌中上調。以上結果提示miRNAs與腫瘤發生發展密切相關。因此,深入了解miRNAs與腫瘤之間的關系將有助于我們更好地了解腫瘤的發病機理。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2021年6月1日至2022年10月河北北方學院附屬第一醫院收治的96名乳腺癌患者作為觀察組,41例乳腺良性增生患者作為良性組,35名健康體檢者作為正常對照組。疾病組平均年齡為(49.34±11.35)歲,乳腺良性增生組平均年齡為(48.96±10.34)歲,對照組平均年齡為(49.11±11.55)歲。3組間的年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。納入標準:①全部患者均簽署了知情同意書;②所有觀察組乳腺癌患者經組織病理學診斷;③全部病例為首次確診,未接受過手術、放化療和生物學治療,未合并其它原位腫瘤;④良性組均經彩超或組織病理學證實;正常對照組無乳腺相關疾病。排除標準:①妊娠及哺乳婦女;②自身免疫疾病;③臨床資料不完整的研究對象。

1.2實驗材料:清晨收集3組外周靜脈血中抽取5mL到試管中,在4℃離心機中進行離心,提取上層血清,將血清放入無RNA酶的EP管中,EP管放入-80℃的冰箱中進行保存。乳腺癌細胞株MCF-7及正常乳腺細胞株HBL-100,購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。1640培養基和青鏈霉素購于美國Sigma公司;胎牛血清購于GIBCO公司;Trizol購于中國上海翌圣生物有限公司;miR-101 mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物公司;CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所;2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix和反轉錄試劑盒購于北京康潤公司;BAX、BCL-2、LC3B、Beclin-1一抗兔抗購于美國Sigma公司。

1.3方 法

1.3.1細胞培養及分組:快速解凍MCF-和HBL-100細胞,離心去除上清,然后在含有1%青霉素/鏈霉素/慶大霉素的90%培養基和10%血清中重懸。將細胞以1×105cells/mL的濃度接種于25cm2的燒瓶中,在37℃、5% CO2的培養箱中培養至細胞融合度達到～80%。用0.25%胰蛋白酶-edta傳代,1500rpm離心;每2天更換一次培養基。細胞分組為空白對照組,miR-101空載組(陰性對照組),miR-101轉染組。

1.3.2熒光定量(qRT-PCR):總RNA用Trizol提取,將提取的RNA提取物反轉錄為cDNA。進行實時定量PCR。用于實時定量PCR的具體miR-101引物序列如下:R-5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA-3',F-5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。引物由上海生工生物有限公司合成。使用2-ΔΔCt方法測量miRNA-101相對于U6的表達。U6引物序列如下:R-5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3',F-5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3CCK-8檢測細胞增殖:根據使用說明,使用CCK-8試劑測定細胞增殖,將細胞以5×104個細胞/孔接種到96孔板中。在24h、48h、72h和96h后,用CCK-8試劑處理細胞并孵育2h。使用Bio-Rad酶標儀(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在450nm波長下測量吸光度。

1.3.4miR-has-miRNA-145表達載體構建及轉染:將MCF-7和HBL-100細胞接種在6孔板中,根據制造商提供的說明,使用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-101mimics和miR-101minics control轉染到細胞中,培養48h后,收集細胞用于分析。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡:使用Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞。獲取處理后的1×105細胞,在避光下用Annexin-V-FITC/PI孵育5min用FACSCalibur流式細胞儀分析凋亡細胞。

1.3.6蛋白質免疫印跡(Western Blot):使用RIPA裂解液提取總蛋白。BCA測定蛋白濃度,進行凝膠電泳,凝膠隨后轉移到PVDF膜上,一抗4℃過夜,二抗孵育2h。采用ECL測量信號。

2 結 果

2.13組患者血清miRNA-101表達比較:PCR結果顯示96例觀察組和41例良性組miRNA-101的相對表達量分別為0.63和0.27,與35例對照組(1.00)相比,差異具有統計學意義。(P<0.01)。見圖1。

圖1 健康對照組、良性組和觀察組血清miRNA-101的表達

圖2 血清miRNA-101的診斷效能

2.2乳腺癌患者血清miRNA-101表達與臨床病理特征的關系:乳腺癌患者血清miRNA-101的表達在年齡、是否絕經和病理類型無顯著性差異(P>0.05),血清miRNA-101的表達在淋巴結轉移、分化程度、腫瘤直徑和TNM分期差異具有顯著性(P<0.01),見表1。

表1 乳腺癌患者血清miRNA-101表達與臨床病理特征的關系

2.3血清miRNA-101評估乳腺癌的受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示:血清miRNA-101鑒別觀察組和良性組的曲線下面積為0.723(95%CI:0.813-0.924),截斷值為0.375時,敏感度和特異度分別為90.24%和89.25%(圖2A)。血清中miRNA-101表達水平觀察組和對照組的曲線下面積為0.875(95%CI:0.835～0.981),截斷值為0.325時,敏感度和特異度分別為94.55%和96.88%(圖2B)。

2.4miRNA-101的表達與過表達載體穩定細胞系的構建:與人乳腺細胞(HBL-100)相比,乳腺癌細胞(MCF-7)miRNA-101的表達顯著降低(P<0.01)(圖3A)。構建miRNA-101過表達載體,qPCR數據結果顯示(圖3B),穩定過表達miRNA-101的MCF-7細胞中,與空白對照組和miR-101空載組相比,miR-101轉染組miR-101的表達量顯著升高(P<0.01)。對照組與miR-101空載組相比,miRNA-101的表達無顯著差異性(P>0.05)。

圖3 miRNA-101在MCF-7和HBL-100細胞表達及miRNA-101過表達載體穩定MCF-7細胞系的構建

2.5CCK-8法檢測不同組之間細胞增殖:通過CCK-8試驗檢測MCF-7細胞增殖能力的改變。如圖4所示,同miR-101空白對照組和miR-145空載組細胞相比,miR-145轉染組細胞增殖能力明顯受到抑制(P<0.05)。

圖4 miR-101轉染對MCF-7細胞增殖能力的影響

2.6miRNA-101對MCF-7細胞自噬和凋亡相關mRNA的影響:由圖5A可知,與對照組相比,miRNA-101轉染組促凋亡基因BAX極顯著上升(P<0.01),抗凋亡基因BCL-2表達極顯著降低(P<0.01)。miRNA-101空載組則無顯著差異(P>0.05)。由圖5B可知,與對照組相比,miRNA-101轉染組自噬相關基因LC3B和Beclin-1表達極顯著降低(P<0.01)。miRNA-101空載組則無顯著差異(P>0.05)。

圖5 miRNA-101對MCF-7細胞自噬和凋亡相關mRNA的影響

2.7miRNA-101對MCF-7細胞自噬和凋亡相關蛋白及凋亡率的影響:miR-101過表達對MCF-7細胞自噬和凋亡影響,與對照組相比,miR-101轉染組BAX蛋白的表達極顯著增加(P<0.01),BCL-2蛋白的表達極顯著降低(P<0.01),miR-101空載組則無顯著差異(P>0.05),同時細胞凋亡率極顯著上升(圖6A,C)。與對照組相比,miR-101轉染組LC3B和Beclin-1蛋白表達極顯著下降(P<0.01),miR-101空載組則無顯著差異(P>0.05)。

圖6 miRNA-101對MCF-7自噬和凋亡相關蛋白及細胞凋亡影響

3 討 論

乳腺癌已成為嚴重危害人類生命的惡性腫瘤之一,其發生與患者年齡、職業和遺傳等因素密切相關[5]。miRNA血清中的表達較為穩定,其不同種類的miRNA在乳腺癌患者血清中的表達存在差異,這種miRNA表達水平的差異使得miRNA成為診斷乳腺癌的血清學標志物的基礎。miR-101屬于腫瘤抑制因子,在喉部鱗狀細胞癌、神經膠質瘤和骨肉瘤等顯著降低[6～8]。本研究發現miR-101在乳腺癌中同樣行使抑癌基因的功能,觀察組患者血清miRNA-101的表達量顯著高于良性增生組和健康對照組。ROC曲線分析表明,miRNA-101可作為乳腺癌早期診斷標志物,對其臨床應用有較高的價值。且miRNA-101在乳腺癌患者血清中的表達水平與淋巴結轉移、分化程度、腫瘤直徑和TNM分期有關。表明miRNA具有高度的可檢測性及穩定的特點,miRNAs與疾病的早期診斷密切相關。

自噬通常被稱為巨自噬,是真核細胞降解底物的主要機制。細胞自噬在演化過程中表現出高度的保守性,其發生和發展受許多與自噬相關的基因控制。miR-101在自噬調節中作為一種抑癌miRNA,可抑制腫瘤的形成。Frankel等研究發現miR-101能顯著降低MCF-7乳腺癌細胞的基礎自噬通量,同時還可抑制由依托泊苷(etoposide)和雷帕霉素介導的細胞自噬[9]。本研究結果顯示,miR-101過表達可顯著降低自噬相關LC3B和Beclin-1基因和蛋白的表達,表明miR-101可抑制MCF-7細胞自噬的發生,符合前人研究結果。

細胞的增殖是生物最主要的生命特征,而細胞的增殖是通過分裂來完成,通過細胞分裂而形成單細胞個體[10]。細胞凋亡,又叫程序性細胞死亡。在器官組織的生長發育、新陳代謝、免疫和異常細胞消除過程發揮著重要的作用[11]。miRNA與細胞增殖和凋亡關系密切,例如過表達miRNA-30b可靶向ITGB3抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲,并促使其凋亡[12]。過表達miR-558可靶向CD155促進乳腺癌細胞的凋亡[13]。在本研究中miR-101在MCF-7細胞中的表達明顯低于HBL-100細胞,且細胞增殖實驗表明過表達miR-101隨著時間的推移可顯著抑制MCF-7細胞的增殖,過表達miR-101可顯著增加MCF-7細胞BAX/BCL-2蛋白和基因的表達,細胞凋亡率增加。上述結果表明miR-101過表達可顯著抑制MCF-7細胞的生長并誘導細胞凋亡。綜上所述,在乳腺癌MCF-7細胞中,過表達miR-101可顯著抑制MCF-7細胞增殖,抑制細胞自噬,促進其凋亡。但有關miRNA-101在乳腺癌臨床治療的價值和抗腫瘤機制仍需更深入研究。