東北春小麥赤霉病抗性鑒定及抗病基因Fhb1檢測

劉東軍,宋維富,楊雪峰,趙麗娟,仇 琳,宋慶杰,張春利,辛文利,肖志敏

(黑龍江省農業科學院作物資源研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是由禾谷鐮孢菌(FusariumgraminearumSchwabe species complex)等多種鐮孢菌引起的一種全球性真菌病害[1]。近年來,赤霉病暴發越來越頻繁,范圍越來越廣泛,危害越來越嚴重[2]。赤霉病不僅顯著降低了小麥的產量和品質[3],而且,病原菌在侵染過程中產生的有毒代謝產物——單端孢霉烯族毒素(trichothecene)被列為第三類致癌物,對食品安全和人畜健康構成嚴重威脅[4-5]。

培育抗性品種是解決赤霉病危害的根本方法,抗源是培育抗性品種的基礎。但是,赤霉病抗源十分匱乏。我國育種工作者通過大量工作篩選出了一些中抗品種(系),如:西農511、揚麥22、寧麥18、揚輻麥2號、皖麥32等[6-14]。由于小麥赤霉病抗性遺傳基礎非常復雜,通過遺傳群體定位的赤霉病抗性數量性狀基因位點(quantitative trait loci, QTLs)多達432個,覆蓋小麥21對染色體[15],培育抗性品種難度極大。當前,赤霉病達到中抗水平的品種非常少,難以滿足生產需求。因此,我國赤霉病主要防治方法仍是選用中抗(感)品種結合化學防治[16]。目前,赤霉病已經命名的抗性基因有Fhb1-Fhb7。其中,Fhb1基因來源于普通小麥,Fhb7基因是來源于長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum),二者均已被克隆,且可顯著減輕赤霉病危害[24-26]。

近年來,隨著全球氣候變暖、雨熱同步效應逐年加強,赤霉病已經成為東北春麥區第一大病害。與長江中下游麥區相比,東北春小麥赤霉病抗源極端匱乏,抗性遺傳基礎研究相對滯后,難以滿足當前小麥赤霉病抗性育種需求。因此,本研究對東北春小麥種質資源進行了赤霉病抗性鑒定,同時對來源于普通小麥且抗性效應明確的Fhb1基因進行了檢測,以期篩選出優異赤霉病抗性種質,加速東北春小麥赤霉病育種進程,提升東北春小麥赤霉病抗性水平。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為1 592份東北春小麥種質資源。其中包括農家品種15份、推廣品種275份和優良品系1 302份。另外引入材料7份(農林34、農林45、13DP33、13DP36、13DP38、13DP39和13DP40)。對照品種為蘇麥3(中抗)、龍麥36(中抗)、龍麥26(中感)、龍麥35(中感)、龍麥33(高感)和龍麥15(高感)。龍麥、龍輻麥和龍春系列小麥品種由黑龍江省農業科學院作物資源研究所提供,克豐、克旱、克澇和克春系列品種由黑龍江省農業科學院克山分院提供,東農系列品種由東北農業大學提供,墾大系列品種由八一農墾大學提供,墾九系列品種由九三農業科學研究所提供,墾紅系列品種由紅興隆農業科學研究所提供,松花江系列品種由黑龍江種質資源庫提供。師大系列材料由哈爾濱師范大學提供,遼春系列來源遼寧省農業科學院農作物種質資源庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 赤霉病抗性鑒定

赤霉病抗性鑒定于2019-2021年在黑龍江省農業科學院民主科技園區的田間病圃和鑒病大棚同時進行。每個材料種植1行,行長1.5 m,行距0.3 m,株距5 cm,設3次重復。赤霉病菌為當地赤霉病優勢致病鐮孢菌混合菌,由黑龍江省農業科學院植保研究所提供。田間病圃鑒定方法:于小麥揚花初期使用注射器進行單花滴注接種,每個品種選取10個發育時期相近的單穗接種,選取穗中部露出黃色花藥小花注入10 μL分生孢子懸浮液(1×104個·mL-1),減去穗頂部作為標記,記錄接種日期,接種后噴霧保濕。鑒病大棚鑒定方法:采用分生孢子噴霧法進行接種。采用分生孢子噴霧法2 d接種1次,接種3～4次,鑒病大棚接種后每天噴霧保濕。接種21 d調查病小穗率。按NY/T2954-2016《小麥區域試驗品種抗赤霉病鑒定技術規程》標準劃分抗性水平和小麥赤霉病嚴重度。田間單花滴注接種鑒定和大棚彌霧接種鑒定取嚴重度高的結果為準。

1.2.2Fhb1基因分子檢測

在小麥三葉期取葉片,采用CTAB法提取小麥基因組DNA[27],用分子標記鑒定Fhb1。采用Su等[28]開發的分子標記,TaHRC-STS-F:5′-ATTCCTACTAGCCGCCTGGT-3′,TaHRC-STS-R:5′-ACTGGGGCAAGCAAACATTG-3′,目標片段大小為1.3 kb。PCR體系中包含1×PCR 緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH8.8,50 mmol·L-1KCl),1.5 mmol·L-1MgCl2,0.2 mol·L-1dNTPs,0.1 mol·L-1引物,rTaqDNA聚合酶5 U·μL-1,40～60 ng模板DNA。PCR反應在PCR儀(ETC811,東勝創新生物科技有限公司,中國)上進行。PCR擴增條件:94 ℃,5 min;95 ℃,30 s,55 ℃,60 s,72 ℃,90 s,35個循環;72 ℃,8 min。PCR 擴增產物用1.0%(g·mL-1)的瓊脂糖凝膠,以120 V恒壓電泳分離,溴化乙啶染色,凝膠成像系統(Essential V6,UVItec,法國)進行照相分析。其中,以蘇麥3號為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 小麥赤霉病抗性鑒定

如表1所示,2019年,通過分生孢子噴霧法和單花滴注法鑒定578份材料,其中,中抗材料9份,占1.56%;中感材料191份,占33.04%;高感材料378份,占65.40%。13DP33、13DP36、13DP38、13DP39、13DP40表現出中抗,均來源于長江中下游麥區。2020年,鑒定501份材料,其中,中抗材料11份,占2.20%;中感材料116份,占23.15%,高感材料374份,占74.65%。2021年,鑒定材料513份,其中,中抗材料9份,占1.75%;中感材料242份,占47.17%;高感材料262份,占51.07%。龍15-1557-1、龍17-4342-2、龍04-4230、龍10-0870和克春9在兩年均表現中抗。三年表型鑒定中抗材料共29份(表2),占1.82%;中感材料549份,占34.48%;高感材料1 014份,占63.69%,赤霉病抗性種質資源較為匱乏,篩選出的29份材料為當地小麥抗性育種提供了寶貴的種質資源。

表1 2019-2021年赤霉病抗性鑒定結果Table 1 Identification results of FHB resistance during 2019-2021

表2 東北春小麥赤霉病抗性種質資源篩選Table 2 Identification of FHB in northeast spring wheat

2.2 Fhb1基因分子檢測結果

分子標記檢測結果(圖1)發現,在來源于日本的農林34、農林45和我國長江中下游麥區的13DP33、13DP36、13DP38、13DP39和13DP40中均檢測出Fhb1基因;1 592份東北春小麥材料中均未檢測到Fhb1基因,表明赤霉病抗性抗性基因Fhb1在東北春小麥種質資源中極其匱乏。29份中抗材料的抗性可能來源于其它赤霉病抗性基因。

M:DL2000;A圖,1:龍19-9718;2:龍19-9719;3:龍春208;4:13DP33;5:13DP36;6:13DP38;7:克春5;8:龍19-9170;9:龍麥15(陰性對照);10:蘇麥3號(陽性對照);11:龍10-0870;12:龍04-4230;13:克14-891;14:農林34;15:農林45;16:龍09-9109;17:克春9;18:龍麥36;19:13DP39;20:13DP40。 B圖,1:龍麥23;2:龍麥24;3:龍麥26;4:龍麥27;5:龍麥29;6:龍麥30;7:龍麥31;8:龍麥32;9:龍麥15(陰性對照);10:蘇麥3號(陽性對照); 11:龍麥33;12:龍麥35;13:龍麥36;14:龍麥37;15:龍麥39;16:龍麥40;17:龍麥51;18:龍麥59;19:龍麥60;20:龍麥67。M:DL2000;Fig.A, 1:Long 19-9718; 2:Long 19-9719; 3:Longchun 208; 4:13DP33; 5:13DP36; 6:13DP38 ; 7:Kechun 5; 8:Long 19-9170; 9:Longmai 15 (negative control); 10:Sumai 3(positive control); 11:Long 10-0870; 12:Long 04-4230; 13:Ke 14-891; 14:Nonglin 34; 15:Nonglin 45; 16:Long 09-9109; 17:Kechun 9; 18:Longmai 36; 19:13DP39; 20:13DP40. Fig.B, 1:Longmai 23;2:Longmai 24;3:Longmai 26;4:Longmai 27;5:Longmai 29; 6:Longmai 30;7:Longmai 31;8:Longmai 32;9:Longmai 15 (negative control); 10:Sumai 3 (positive control) ; 11:Longmai 33; 12:Longmai 35; 13:Longmai 36; 14:Longmai 37;15:Longmai 39;16:Longmai 40; 17:Longmai 51; 18:Longmai 59;19:Longmai 60;20:Longmai 67.圖1 小麥赤霉病抗性基因Fhb1分子標記Fig.1 Molecular marker analysis of FHB resistance gene Fhb1of wheat

3 討論

3.1 拓寬東北春小麥赤霉病抗性種質資源庫極為迫切

隨著全球氣候變暖,小麥赤霉病的發生愈加頻繁和嚴重。從赤霉病防治角度來看。培育赤霉病抗性品種是減輕赤霉病危害的最根本、最經濟的方法。抗源是培育小麥赤霉病抗性品種根本,我國針對抗源篩選進行了大量研究,并取得了一些進展,2017-2021年,翟文玲等[7]鑒定了642份小麥種質資源的赤霉病抗擴展性,從中篩選出高抗種質9份,占比1.40%,中抗種質81份,占比12.62%。曹淑琳等[29]從江蘇省主推和新育成的280個小麥品種中,篩選到中抗及以上小麥種質85份,占比30.36%。胡文靜等[10]發現黃淮麥區71個主栽小麥品種(系)中,7份為中抗,占比7.0%,17份材料為中感,占比24%。然而,東北春小麥赤霉病種質資源中,中抗品種/系29份,占比僅1.82%,顯著低于長江中下游麥區、黃淮麥區以及我國平均比例,表明東北春小麥赤霉病抗性種質資源十分匱乏。當前,赤霉病危害越來越嚴重,利用外引赤霉病抗性種質拓寬東北春小麥赤霉病抗性種質資源庫十分迫切。

3.2 加強赤霉病抗性基因在東北春小麥中的利用

目前,多項研究發現Fhb1基因可顯著降低赤霉病危害。張宏軍等[30]將Fhb1導入周麥16(赤霉病高感品種),通過對攜帶和不攜帶Fhb1基因的近等基因系的赤霉病抗性鑒定結果發現:Fhb1顯著提升了小麥赤霉病抗性。許峰等[31]和馬紅勃等[32]將Fhb1基因導入感病品種矮抗58中,顯著提高了株系赤霉病的抗擴展能力。代旭冉等[33]發現含Fhb1基因后代株系平均病小穗數和嚴重度均低于對照和輪回親本。此外,山東農業大學發現來源于長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum)Fhb7可降低赤霉病危害[26],提升小麥赤霉病抗性水平。

通過小麥赤霉病表型鑒定發現:江蘇省59份小麥品種(系)中,9份攜帶Fhb1,占比15.25%[34]。四川省153份小麥品種/系中,12份含Fhb1,占比7.8%[35]。寧麥系列23個品種中,攜帶Fhb1材料11個,占比高達48.6%[36]。本研究中,除外引材料外,1 592份東北春小麥品種/系均未檢測到Fhb1。因此,在東北春麥區,可加強赤霉病抗性基因Fhb1、Fhb7等應用來提升赤霉病抗性水平。目前,本團隊利用分子標記和選擇性回交技術將Fhb1基因導入東北優質強筋春小麥遺傳背景中。

3.3 東北春小麥赤霉病抗性遺傳基礎有待發掘

胡文靜等[31]發現,長江中下游地區小麥赤霉病抗性達到中感及以上水平的品種,攜帶Fhb1基因僅占26.9%,說明Fhb1基因并非解決小麥赤霉病的唯一選擇。翟文玲等[8]對抗性種質資源的分子標記發現:抗性種質,如浩麥1號、冀師7225-28、南農13Y110、石優17和武農6號等不攜帶目前已知抗赤霉病基因或QTLs[8]。廖森等[34]發現抗性種質,如:寧麥1529、鎮麥13322、K122、寧麥17320、寧麥17110和寧麥15219均不含Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5和QFhs.crc-2DL等已知抗性基因,表明可能存在著其他未被發掘的赤霉病抗性基因。本研究中的29份中抗材料均未檢測到抗病基因Fhb1,推測可能存在其他赤霉病抗性基因,有待于進一步研究。