微管馬達驅動蛋白4A在胃癌中表達水平及其與預后關系

王 立, 謝 靜, 宋 毅, 謝 鵬, 賀小武, 余力棟, 嚴 爍, 周建平

1.聯勤保障部隊第九〇六醫院 普通外科,浙江 寧波 315040;2.寧波美晶醫療技術有限公司,浙江 寧波 315040

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一,截止2021年,胃癌在世界范圍內發病率位于腫瘤的第5位,病死率高居腫瘤第4位,中國是胃癌大國,每年新發胃癌病例全球第一,幾乎占到全球每年新發病例的50%[1]。由于缺乏早期特異性癥狀,且早期篩查率低,我國胃癌患者預后更差[2-3]。近年來,隨著分子生物學檢測的發展,胃癌的診斷及預后評估已不僅僅局限于組織學[4],找出對胃癌的診斷及預后評估具有意義的新分子生物學標記物非常重要。微管馬達驅動蛋白4A(KIF4A)屬于kinesin-4家族成員,其在有絲分裂中通過參與染色質的濃縮及分離、紡錘體的分離及細胞質的移動對真核細胞有絲分裂的管控、調節起著重要作用[5]。KIF4A表達異常已在多種人類癌癥細胞中被發現[6-7]。江濤等[6]發現,KIF4A在結直腸癌中高表達,且與直腸癌轉移相關。Wang等[7]研究報道,KIF4A與阿霉素誘導的乳腺癌細胞凋亡相關,影響乳腺癌患者預后。本研究旨在探討KIF4A在胃癌組織中的表達水平及其與預后的關系。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 將聯勤保障部隊906醫院自2021年6月至2022年5月收治的接受手術治療的19例胃癌患者納入A組。把患者術中切下的新鮮胃癌組織及相應癌旁正常組織(距離腫瘤>5 cm)加入RNA保存液中,置入-80℃冰箱存放,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測。再將本院自2006年5月至2015年4月收治的接受手術治療的103例胃癌患者納入B組,通過手術獲得103例石蠟包埋胃癌樣本,通過胃鏡獲得35例正常組織樣本。將B組樣本制成組織芯片,采用免疫組化二部法染色方法進行染色,并由病理醫師確認結果。兩組患者術前均未接受放療、化療,且未合并其他惡性腫瘤。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit(德國QIAGEN 公司),Power SYBRTM Green PCR預混液、7500實時熒光PCR儀(美國 Applied Biosystems公司),KIF4A和GAPDH基因引物(上海生工公司),一抗、KIF4A 抗體(武漢ABclonal 公司),兔二抗、DAB顯色試劑盒(上海碧云天公司),CX43生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 RNA提取及實時熒光定量PCR 按照產品說明書使用RNeasy Plus Mini Kit對19對新鮮樣本進行RNA提取,以此為逆轉錄模板生成cDNA。KIF4A擴增的正向引物為5′-AAACGCCATCTGAATGACCTC-3′,反向引物為5′-CGAAACTTGACCACGCACT-3′。GAPDH作為同一個定量PCR反應中的內參,其正向引物為5′-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物為5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。擴增條件:1個預變性階段(95℃,5 min)和40個循環的擴增定量階段(95℃,15 s;60℃,45 s)。每個樣本的實驗均需重復3次。Ct表示目的基因的熒光值設定的閾值時反應循環數。采用公式△△Ct=△Ct(腫瘤樣本)-△Ct(對照樣本)計算每個腫瘤樣本對于正常對照樣本目的基因的相對Ct值差異。

1.4 組織芯片免疫組化分析 對4 μm厚的組織芯片樣本進行脫蠟、水化、檸檬酸抗原修復,加內源性過氧化酶阻斷劑,加KIF4A一抗(1∶100)過夜,加兔二抗,DAB顯色,蘇木精復染,封片。實驗中陰性對照使用PBS代替一抗進行蘇木精染色。結果由兩名病理科醫師進行判讀。評分標準:染色面積0～3分,未著色0分,面積<25% 1分,25%～75% 2分,面積>75% 3分;染色強度0～3分,未著色0分,淡黃色1分,黃色2分,棕色3分。以染色面積與染色強度的乘積為最終評分,按最終評分將樣本分為陰性組(評分<3分)和陽性組(評分≥3分)。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料以例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher精準概率法。生存曲線以Kaplan-Meier評估,比較采用log-rank檢驗。采用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型預測生存時間。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIF4A mRNA在胃癌組織及相應癌旁正常組織中mRNA水平比較 在A組的19對樣本中,13例胃癌組織中的KIF4A mRNA水平低于其相應癌旁正常組織。見圖1。

圖1 A組19對樣本KIF4A mRNA表達量差(腫瘤組織-正常組織)

2.2 胃癌和正常組織樣本中KIF4A蛋白陽性率比較 KIF4A蛋白主要表達于細胞質。B組103例胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率為58.3%(60/103),35例正常組織樣本的KIF4A蛋白陽性率為80.0%(28/35)。胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率低于正常組織樣本,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 B組胃癌和正常組織免疫組化染色圖片(a.胃癌組織,IHC×100;b.胃癌組織,IHC×400;c.正常組織,IHC×100;d.正常組織,IHC×400)

2.3 KIF4A表達與臨床病理特征關系 KIF4A與胃壁浸潤深度、TNM分期相關(P<0.05)。見表1。

表1 KIF4A表達與臨床病理特征關系/例(百分率/%)

2.4 KIF4A表達對胃癌患者生存時間影響Kaplan-Meier曲線 以電話或門診形式對B組患者進行隨訪,隨訪至2022年12月,隨訪率為100.0%(103/103)。隨訪中,49例患者死亡,中位生存時間為58個月。KIF4A陰性組患者總生存時間短于KIF4A陽性組患者,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 KIF4A表達對胃癌患者生存時間影響Kaplan-Meier曲線

2.5 胃癌患者生存時間影響因素分析 在單因素Cox風險回歸模型中,KIF4A表達水平、TNM分期、分化程度、胃壁浸潤深度、淋巴結轉移與生存時間相關(P<0.05)。為校正上述結果,將單因素分析中的陽性因素納入多因素Cox回歸,結果提示,KIF4A表達水平、TNM分期、分化程度可以作為胃癌的預后影響因子(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌患者生存時間影響因素分析

3 討論

KIF4A最早在小鼠的中樞神經系統中被發現,其在神經細胞的物質轉運中發揮作用[8]。KIF4A的異常表達與多種疾病相關,如艾滋病毒感染[9]、阿爾茨海默病[10]及多種癌癥(包括口腔癌[11]、骨肉瘤[12]、胰腺導管腺癌[13]、肝癌[14]、腎透明細胞癌[15]、子宮癌[16]、腸癌[17])等。KIF4A在腫瘤中的表達似乎具有兩面性,其低表達或過表達均可能抑制癌細胞的增殖或遷移。例如:KIF4A在肝癌和宮頸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織[18-19],乙型肝炎病毒可能激活KIF4A基因啟動子,上調KIF4A mRNA和蛋白表達,最終導致肝癌發生[14];而另一方面,KIF4A在多發性骨髓瘤和急性髓系白血病[20]中表達顯著降低,骨肉瘤中的KIF4A表達增加也會顯著抑制腫瘤生長[12],有動物實驗發現,基因敲除KIF4A可引起小鼠胚胎干細胞非整倍體發生,最后導致裸鼠體內形成腫瘤[21]。這可能與KIF4A在不同腫瘤中具有不同的調節機制有關[22]。

有研究報道,KIF4A的表達可抑制胃癌細胞系增殖[23]。本研究首先通過熒光定量PCR發現胃癌組織中的KIF4A mRNA水平低于其相應癌旁正常組織,然后再通過免疫組化染色方法發現組織芯片中胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率低于正常組織樣本,進一步結合臨床病理特征分析發現KIF4A與胃壁浸潤深度、TNM分期相關,最后在多因素分析中發現KIF4A表達水平、TNM分期、分化程度可以作為胃癌的預后影響因子。胃癌患者KIF4A低表達與不良預后相關可能是由于KIF4A缺失會導致有絲分裂缺陷,包括染色體過縮、紡錘體異常形成、后期橋、細胞質分裂缺陷和非整倍體產生[24]。上述問題中的任何一個均可能會激活有絲分裂檢查點和DNA損傷反應途徑。盡管大部分有絲分裂缺陷細胞會通過凋亡或細胞周期阻滯被消滅,但仍有少部分基因缺陷會逃脫這些檢查點,最終促進腫瘤的發生和發展[25]。

綜上所述,KIF4A表達水平與胃癌惡性程度呈負相關,其低表達提示預后不良。隨著研究的深入,KIF4A可能有助于胃癌治療領域新靶點的發現。