HPLC同時測定醬香型白酒酒糟中13種有機酸的分析研究

侯 睿，向麗萍，張冰雪，任 偉，張 琴，駱書娜

（遵義市產品質量檢驗檢測院，貴州遵義 563099）

醬香型白酒酒糟中的風味物質含量很高，尤其有機酸類，總酸含量可達4 %左右，而且其酸的組成豐富，口感協調，主要以乳酸為主[1-2]。醬香型白酒有機酸大部分是在釀酒發酵中產生的，調節白酒的香氣結構，使得白酒具有酒體豐滿度和酸爽感。所以，醬香型白酒的釀造過程也是一個對有機酸的利用和控制過程，對酒糟中有機酸的檢測必不可少[3-4]。乳酸是白酒中重要的呈香呈味物質，也是最重要的非揮發性有機酸之一，在醬香型白酒釀造過程中，大量生酸微生物代謝產生的酸參與調控微生物的分布趨勢，導致醬香型白酒中的酸含量比較高，最常見的有乳酸、丁酸等[5]。

目前，白酒酒糟有機酸的檢測方法通常有氣相色譜/質譜聯用法(GC-MS)[6]、氣相色譜法(GC)[7]、離子色譜法(ICP-MS)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜/質譜聯用法(HPLC-MS)[10]等。氣相色譜法適用于揮發性高的脂肪酸檢測，不適合熱不穩定酸(如乳酸)的檢測；液相(質)衍生技術可以實現乳酸等熱不穩定酸的檢測，但操作繁瑣[11-13]；陰離子交換色譜法可實現白酒短、中鏈揮發酸和包括乳酸在內的難揮發酸的同時檢測，但儀器專用、購置成本高[14-15]；高分辨液相質譜可實現酒中多種微量有機酸的檢測，但儀器和檢測成本昂貴[16]。液相色譜法成本相對較低，流動相常見易得，在白酒有機酸的檢測中應用較多，已實現了對乙酸、乳酸及其他熱不穩定酸的檢測[17-20]。本試驗通過HPLC建立醬香型白酒酒糟中有機酸一步分離方法，采用有機酸標準物質的保留時間定性，峰面積定量，為全面了解醬香型白酒酒糟中有機酸構成與含量變化如何影響醬香型白酒酒質，開展白酒釀造工藝的改進提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：醬香型白酒酒糟樣品(3 個車間七輪次酒糟，取于遵義市茅臺鎮某酒廠)。

試劑及耗材：苯丙二酸、檸檬酸、維生素C、戊二酸、琥珀酸、草酸、異戊酸、丙酸、丁酸、L-乳酸、蘋果酸、奎寧酸、富馬酸(標準品)，均購買自上海安譜世標準技術服務有限公司；甲醇(色譜純)，德國默克公司；磷酸二氫鉀(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司。

儀器設備：AgiLent-1260 高效液相色譜儀(配備DAD 檢測器)；Waters T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μ m)；AΒ265-S 電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；KQ-600E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；pH 計(上海精密科學儀器有限公司)；D-24UV 超純水系統(默克密理博)；旋轉混勻儀(上海滬析實業有限公司)；離心機(德國SIGMA)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

（1）有機酸儲備液配制。分別精確稱取0.1 g蘋果酸、0.2 g 維生素C、0.2 g 戊二酸、0.2 g 富馬酸、0.2 g 琥珀酸、0.2 g 苯丙二酸、0.1 g 檸檬酸、0.05 g乳酸、0.08 g 丁酸、0.5 g 丙酸、0.5 g 異戊酸、0.2 g 草酸、0.2 g奎寧酸于10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋溶解并定容，配制成10 mg/mL 蘋果酸、20 mg/mL維生素C、20 mg/mL 戊二酸、20 mg/mL 富馬酸、20 mg/mL 琥珀酸、20 mg/mL 苯丙二酸、10 mg/mL檸 檬 酸、5.0 mg/mL 乳 酸、8.0 mg/mL 丁 酸、50 mg/mL 丙酸、50 mg/mL 異戊酸、20 mg/mL 草酸、20 mg/mL奎寧酸標準儲備液，0～4 ℃冰箱儲存。

（2）有機酸標準溶液配制。準確移取適量13 種單標儲備液混合于10 mL 容量瓶中，將有機酸儲備液按一定比例混合，流動相定容配制成1.0 mg/mL 的混合標準有機酸使用溶液，用流動相配制成不同濃度梯度的系列標準工作溶液。準確移取適量13種單標儲備液于10 mL容量瓶中，分別配成1.0 mg/mL 的標準使用單標溶液，單標溶液和混合標準溶液中同種類的有機酸濃度相同。0～4 ℃儲存。

1.2.2 色譜條件的選擇

色譜柱：Waters T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μ m)；檢測波長：210 nm；流速：0.40 mL/min；進樣量：10 μ L；流動相：KH2PO4緩沖溶液(20 mmol/L，pH2.6)和甲醇；柱溫：25 ℃；梯度洗脫程序見表1，流動相A 為KH2PO4緩沖溶液(20 mmol/L，pH2.6)，流動相Β為甲醇。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

2 結果與分析

2.1 色譜條件對有機酸組分分離效果的影響

2.1.1 流動相中KH2PO4溶液濃度的選擇

有機酸在酸性環境中比較穩定，容易被分離，參考色譜柱對pH 值和鹽濃度的耐受能力，選擇pH2.6的條件下，KH2PO4溶液濃度分別為2 mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L，其結果表明，在KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L 時維生素C 和L-乳酸達到分離，在其他濃度時峰有重疊現象。

2.1.2 流動相中甲醇含量的選擇

在流動相KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L 時，改變流動相Β 甲醇的比例，進行梯度洗脫，隨著甲醇的比例上升，會導致磷酸鹽的析出而造成色譜柱堵塞，故梯度洗脫的終點設置為42 %。設置梯度洗脫方式3 種，對有機酸分離度較為明顯，梯度洗脫見表2。其中梯度洗脫1 效果最佳，其他兩種洗脫方式會造成色譜峰大部分重疊，在45～55 min時會出現基線突然飄高的情況。

2.1.3 流速的選擇

在流動相KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L，梯度洗脫方式為1 時，設置流速分別為0.38 mL/min、0.40 mL/min、0.42 mL/min，由實驗可知，0.40 mL/min流速最佳，0.38 mL/min 流速過慢，導致維生素C 峰有拖尾的現象，影響L-乳酸的出峰情況，0.42 mL/min流速過快，導致丁酸與苯丙二酸峰完全重疊，鑒于二者情況，選擇0.40 mL/min的流速。

2.2 有機酸標準曲線建立

使用0.02～5.0 mg/mL 不同濃度梯度的系列標準工作溶液，按1.2 方法進行HPLC 檢測。有機酸單標確定各有機酸的分離時間，13 種有機酸HPLC圖見圖1。進行線性回歸方程計算，13 種有機酸標準曲線相關系數均大于0.99，取信噪比S/N=3 和S/N=10 時對應分析物的濃度作為檢出限和定量限，結果如表3所示。

圖1 13種有機酸HPLC圖

表3 13種有機酸類的標準曲線線性、檢出限、定量限

2.3 加標回收試驗

稱取酒糟樣品作為空白基質，加入適量有機酸標液，同樣品進行前處理，1.2 色譜條件HPLC 檢測，加標回收結果見表4，回收率在84.0 %～111.0%。

表4 加標回收率試驗結果

2.4 重復性與精密度試驗

取13 種有機酸混合標準溶液10.0 μ L，按照1.2色譜條件進行HPLC檢測，連續上樣6次，通過分析有機酸的峰面積，計算峰面積的相對平均偏差(RSD)來評價方法的重復性與精密度，峰面積重復性相對標準偏差(RSD)＜5 %，重復性和精密度較好，有機酸混合標準溶液的重復性與精密度見表5。

表5 13種有機酸的峰面積重復性與精密度

2.5 不同車間第七輪次醬香型白酒酒糟有機酸檢測

稱取酒糟樣品5.0 g，加入60%乙醇溶液10 mL，渦旋混勻20 min，在25 ℃下超聲波振蕩提取60 min，將浸出液以9000 r/min 離心10 min，取上清液，用0.45 μ m 尼龍膜過濾后按照1.2 色譜條件HPLC檢測，結果見表6。

表6 不同車間第七輪次醬香型白酒酒糟有機酸含量(mg/mL)

對三個車間酒糟進行準確定量和比較分析，由表6 數據可知，在醬香型白酒生產工藝一樣的情況下，三個車間七輪次酒糟的有機酸含量和種類都具有差異性，而且幾個車間有機酸的含量各不相同，車間3 乳酸含量明顯比車間1 和車間2 高，總的有機酸含量也比較高。在醬香型白酒中，酸度大了，會影響發酵，發酵不好，也會使總酸含量增加，造成出酒率降低。醬香型白酒中乳酸含量是比較高的，但是乳酸含量也不能過高，高了可能會影響產量，乳酸含量過低會影響酒質，車間3 的酒質和產酒量都是這幾個車間中最差的。因此，在醬香型白酒發酵過程中，可以通過檢測酒糟中有機酸的含量，進一步加強和優化白酒中有機酸的品質控制，生產出更加優質的醬香型白酒。

3 結論

利用高效液相色譜法（HPLC）建立醬香型白酒酒糟有機酸定性定量的方法，實現了13 種有機酸的有效分離，該方法處理簡單，流動相為常見的甲醇和水，方法快速高效，且樣品檢測方法精密度、重復性、回收率實驗基本符合要求。本方法可以用于檢測酒糟有機酸的含量，進一步加強和優化白酒中有機酸的品質控制，生產出更加優質的醬香型白酒，為開展白酒釀造工藝的改進提供一定的技術支撐。