腦泰通組方對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的影響及保護機制

樂金海 林湘東 向 茗 張 強 胡 哲

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院,長沙,410007; 2 湖南中醫藥大學中醫診斷研究所,長沙,410208)

缺血性腦血管疾病是致殘、死亡的重要危險因素[1-2]。缺血性腦血管疾病往往發病突然,若未得到及時救治極易造成腦組織的不可逆損害,存在諸如半側肢體功能障礙、語言障礙等后遺癥,是嚴重威脅居民健康與生命、降低患者生命質量、增加患者不良事件風險的常見病、多發病[3]。現階段缺血性腦血管疾病是醫學界頗為棘手的難題,是研究者亟須攻克的臨床重點,當前臨床治療本病的關鍵是重建腦組織血運,恢復缺血區域血液供應,改善腦組織損傷程度[4]。但是CAMPBELL等[5]研究顯示,腦卒中患者的腦組織在重建血運之后,缺血再灌注的腦組織會發生異常凋亡事件,觸發局部腦組織一系列級聯效應,反而加劇缺血區域的損傷程度,形成缺血再灌注損傷。尋求治療缺血性腦血管疾病,保護腦組織缺血區域再灌注損傷的治療方法意義重大。

缺血性腦血管疾病屬于中醫學“中風”“卒中”等范疇[6],諸多醫家對本病的病因病機及發展預后多有論述,認為“氣虛血瘀,腦絡受阻”是本病的基本病機,“益氣活血,護腦安神”是治療本病的基本原則[7-8]。腦泰通組方是湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療缺血性腦血管疾病的效方,在多年的臨床運用中取得了顯著、穩定的療效,不良反應較小,但其具體作用機制仍需要進一步明確。尼莫地平是目前臨床用于改善急性腦血管病血液循環的西藥,目前該藥聯合中醫藥治療腦卒中、改善腦缺血病變的研究較多,但其聯合中藥復方改善腦組織缺血再灌注的研究鮮有報道。本研究以前期預實驗為基礎,采用大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型構建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,基于轉錄因子叉頭框蛋白O3a(Forkhead Box O3a,FoxO3a)/低氧誘導因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)/核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)信號通路探討腦泰通組方對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的影響及保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 100只無特定病原體動物(Specific Pathogen Free,SPF)級健康雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,6～7周齡,180～200 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004,合格證號:43072663411303347,實驗前給予1周適應飼養,環境溫度22～26 ℃,濕度55%～60%,自由攝食,實驗全程按照動物倫理學標準進行(倫理審批號:LL201818B240)。

1.1.2 藥物 腦泰通組方中藥材購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房,經制劑鑒定中心鑒定合格,具體藥物組成:黃芪20 g、當歸10 g、赤芍10 g、川芎10 g、桃仁10 g、紅花10 g、三七10 g、人參10 g、地龍10 g。上述中藥材經純凈水浸泡1 h后由制劑室根據人等效劑量進行水煎濃縮為浸膏劑,使其終濃度為1.80 g/mL,置于常溫下陰涼處儲存;尼莫地平(拜耳醫藥保健有限公司,德國,批號:20210307)。

1.1.3 試劑與儀器 FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、腦源性神經營養因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、B細胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)抗體(Proteintech公司,美國,貨號:66428-1-Ig、20960-1-AP、10745-1-AP、28205-1-AP、12789-1-AP、50599-2-Ig);HRP goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech公司,美國,貨號:SA00001-1);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS)(Hyclone公司,美國,貨號:80334412);電鏡(徠卡公司,德國,型號:8344-Ⅱ);熒光PCR板(Thermo,美國,型號:66347-A);電動搖床(江蘇其林貝爾儀器制造公司,型號:TS-92);水平瓊脂糖電泳槽(北京六一儀器廠,型號:JK3056);熒光定量PCR儀(Thermo,美國,型號:PIKOREAL96);電泳儀(北京六一儀器廠,型號:DYY-2C);轉膜儀(北京六一儀器廠,型號:DYCZ-40D),其余實驗試劑及儀器均由實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參考MIAO等[9]的局灶性腦缺血再灌注大鼠模型構建方法(MCAO法),具體為:隨機選取90只SPF級SD大鼠,術前禁食12 h,制備尼龍繩栓結,配制10%水合氯醛(300 mg/kg)。麻醉大鼠后取仰臥位頸中部術口,分離各層組織及右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈,于頸總動脈分叉近心端結扎頸外動脈并以小動物動脈夾阻斷血流,于頸外動脈分叉行V形切口,將制備好的無菌尼龍繩栓結緩慢放入并收緊線結,放開小動物動脈夾,緩慢將尼龍繩栓結沿著冠狀動脈經過頸內動脈放入大鼠腦內,放入約20 mm,感覺到存在阻力時立即停止放入線結,使線結尾端平齊冠狀動脈起始處,阻斷冠狀動脈血流,拉緊尼龍繩,行止血操作,縫合術口,單籠飼養。待大鼠蘇醒后,根據美國國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評分法對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型進行評價,即NIHSS評分2～3分的大鼠視為成模,納入后續研究。在本研究,共死亡24只,成功造模53只。隨機選取40只已成模的局灶性腦缺血再灌注大鼠,分為模型對照組、陽性藥物組(尼莫地平組)、中藥組(腦泰通組方組)、聯合用藥組(尼莫地平+腦泰通組方組),每組10只。另選取10只健康的SPF級SD大鼠作為假手術組,僅給予同部位分離頸內、外動脈及頸總動脈,不用尼龍繩栓結。

1.2.2 給藥方法 假手術組與模型對照組均予以2 mL的0.9%生理鹽水灌胃;中藥組大鼠給予腦泰通組方浸膏灌胃,給藥劑量0.9 g/kg,1次/d;陽性藥物組給予尼莫地平片粉末溶于2 mL的0.9%生理鹽水灌胃,給藥劑量16.2 mg/kg,1次/d;聯合用藥組給予尼莫地平片+腦泰通組方浸膏灌胃,劑量同前,1次/d。各組均連續干預7 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 NIHSS評分測定 根據KWAH等[10]制定的NIHSS評分標準,在干預后1 d、3 d、7 d分別進行NIHSS評分測定:緩慢抓起大鼠尾部,距離實驗臺約10 cm,前爪趴于臺面,輕柔推動其前肢大關節直至向前滑動2 cm,選擇方向測試數次,腦組織未損傷大鼠在反方向可感受到抵抗,腦組織損傷大鼠則呈偏癱狀前爪屈曲。正常記為0分;前爪屈曲,抓尾試驗陽性記1分;前推抵抗程度明顯下降,前爪屈曲記2分;自發單側轉圈,爬行時出現偏癱記3分。

1.2.3.2 腦組織含水量測定 各組大鼠在最后1次干預2 h后處死,完整取出腦組織,于精準天平稱取腦組織濕重,后置于烘箱烘干后稱取腦組織干重,腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.3.3 腦組織缺血體積百分比測定 取出完整的腦組織后以大腦冠狀溝線進行切片,放入1%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride,TTC)染色液中孵育20 min,健康腦組織表現為鮮紅色,缺血腦組織表現為白色,借助Image Pro Plus軟件分析腦組織缺血體積百分率,腦組織缺血體積百分率(%)=腦組織切片缺血區域面積/腦組織切片總面積×100%。

1.2.3.4 免疫組織化學法染色 根據說明書步驟進行操作:脫蠟后進行封閉,添加一抗、二抗,二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色,進一步脫水、封片,隨機選取5個視野進行分析,用Image Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。

1.2.3.5 蛋白質免疫印跡檢測大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達水平 提取各組大鼠腦組織總蛋白,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)后將蛋白置于聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉完全封閉孵育60 min,添加一抗抗體FoxO3a(1∶1 000),HIF-1α(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),BDNF(1∶1 000),4 ℃環境下靜置12 h,棄去一抗,洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜3次,每次5 min。室溫孵育二抗2 h,洗滌后棄去二抗,TBST洗膜3次,每次5 min。顯色后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)作為內參,計算各蛋白的灰度比值。

1.2.3.6 實時定量PCR檢測大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB和BDNF的mRNA表達水平 提取大鼠腦組織總RNA,逆轉錄為cDNA,特異性擴增FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF。反應條件為95 ℃,10 min變性;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;40次循環。采用2-△△Ct法計算各蛋白的表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠NIHSS評分比較 假手術組大鼠未發現明顯的神經功能缺損。對各組大鼠于干預后1 d、3 d、7 d分別進行NIHSS評分,模型對照組大鼠的NIHSS評分均隨著時間推移而升高,存在明顯的時間推移效應,而陽性藥物組、中藥組、聯合用藥組大鼠的NIHSS評分均隨著時間推移而降低,差異均有統計學意義(均P<0.05),其中聯合用藥組大鼠在不同時間點的NIHSS評分均低于陽性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組局灶性腦缺血再灌注大鼠模型NIHSS評分比較分,n=10)

2.2 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較 假手術組的腦組織含水量顯著低于模型對照組(P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著降低(均P<0.05),其中聯合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著低于陽性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較

2.3 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較 假手術組Bax、Bcl-2均處于較低水平,在造模各組中,模型對照組Bax表達水平最高,中藥組、陽性藥物組、聯合用藥組Bax表達水平依次降低;模型對照組Bcl-2表達水平最低,中藥組、陽性藥物組、聯合用藥組Bax表達水平依次升高。假手術組大鼠腦組織Bax、Bcl-2平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著低于模型對照組(均P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯合用藥組的腦組織Bax平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著降低(均P<0.05),其中聯合用藥組的降低程度最大(P<0.05);Bcl-2平均光密度值顯著升高(P<0.05),其中聯合用藥組的升高程度最大(P<0.05),提示腦泰通組方可有效抑制腦組織凋亡,對腦組織具有保護作用。見圖1,表4。

圖1 大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達情況(DAB染色,×200)

表4 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較

2.4 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達水平比較 與假手術組比較,模型對照組腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達水平均顯著升高(均P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯合用藥組的腦組織NF-κB蛋白及mRNA的表達水平顯著降低(均P<0.05),其中聯合用藥組的降低程度最大(P<0.05),FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達水平顯著升高(均P<0.05),其中聯合用藥組的升高程度最大(P<0.05)。見圖2,表5～6。

圖2 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達水平

表5 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達水平比較

表6 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF mRNA表達情況

3 討論

缺血性腦血管疾病的臨床發病率較高并呈現出逐年增加趨勢,臨床預后較差,致殘率較高,是目前亟須解決的重大衛生問題[2]。中醫學認為,缺血性腦血管疾病屬于“本虛標實”之證,其中病機關鍵在于“氣虛血瘀,腦絡受阻”。氣虛使血行不利,血行滯緩,日久成瘀,阻塞腦絡,最終發為本病。現代醫學認為,缺血性腦血管疾病的主要發病機制為腦組織內血管被血栓堵塞、血液循環受限造成局部腦組織氧分及營養供應不足,誘發腦組織神經一系列的級聯反應與細胞凋亡,導致神經生物信號紊亂及功能障礙,并由此產生的致殘、致死等不良事件,嚴重威脅著患者的健康與生命,此外導致的后遺癥造成患者的生命質量顯著下降,預后不佳[11-14]。XUE等[15]針對缺血性腦血管疾病的中西醫結合研究進展顯示,氣虛血瘀主要體現在腦組織內血栓形成,或動脈內管腔狹窄,導致血液循環速度減慢,同時各種缺氧級聯反應持續發生,炎癥介質釋放,極大地損傷腦組織及神經的形態與功能。因此,中醫治療缺血性腦血管疾病的總體原則為益氣活血、護腦安神。由于缺血性腦血管疾病的特殊性及復雜性,針對本病發現新的治療手段已成為醫學界的研究熱點。腦泰通組方化裁于中醫經典方劑補陽還五湯,具有益氣活血、護腦安神的功效。現階段,中醫藥因其多作用靶點、多信號通路、多層次、綜合性的整體調控作用備受矚目[16]。

本研究采取MCAO法構建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,本造模方法屬于比較成熟、穩定的造模方法,為本研究的實施提供了動物模型基礎。研究顯示,缺血性腦血管疾病的發生發展存在多種復雜的機制,涉及到細胞信號紊亂、細胞凋亡、組織重構、缺氧級聯反應、炎癥反應、氧化應激等生物學過程[17]。本研究結果顯示,腦泰通組方能有效保護局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細胞凋亡及炎癥反應,同時能夠有效促進FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達水平,抑制NF-κB蛋白及mRNA的表達水平。FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路是近年來發現的缺血性腦血管疾病的重要信號通路,其密切參與到腦組織內細胞增殖、凋亡、分化、缺氧反應及炎癥反應過程中,對調控腦組織及神經細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程具有重要作用[18]。

FoxO3a被稱為“人類長壽的密碼”,廣泛存在于人體組織中,與人類衰老表型密切相關[19],TAN等[20]研究顯示,FoxO3a屬于人體內非常重要的能量代謝調控蛋白,其在人體腦組織、心肌組織等高能量代謝的組織內的表達量顯著高于其他部位;LI等[21]研究表明,FoxO3a能夠對應激性代謝過程進行調節,其表達水平上升能夠有效保護人體組織免受氧化應激及炎癥反應的損害,尤其是腦組織等需氧量較多的高能量代謝部位。在缺血性腦血管疾病中,存在著極為復雜的缺氧級聯反應以及組織重構,HIF-1α屬于代謝調節蛋白,RAHMATI等[22]研究顯示,在缺血性腦血管疾病中HIF-1α能夠有效調節缺血缺氧時腦組織細胞內的氧平衡,維持在缺氧缺血狀態下的內環境穩態,并調節細胞適應缺氧。BDNF是人體內最重要的神經營養因子,其對腦組織及神經細胞存在顯著的保護效應[23],同時BEMBENEK等[24]研究顯示,BDNF對腦組織及神經細胞的重構、細胞生長再生具有重要的維持和促進作用。此外,CHEN等[25]研究顯示FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路對于腦組織缺血后的腦血管復通、重構血管通道、細胞骨架蛋白構建等存在重要的調控功能,這對于缺血性腦血管疾病的治療與康復具有重要意義。研究該信號通路在缺血性腦血管疾病的具體作用機制,為本病的治療提供了新的思路及方法,是較為值得去嘗試的重要研究方向。

綜上所述,腦泰通組方契合缺血性腦血管疾病的病因病機,能有效保護局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細胞凋亡及炎癥反應,并與西藥聯用存在較明顯的“協同增效”作用,其作用機制可能與腦泰通組方調控FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路相關蛋白表達相關。本研究結果凸顯了中西醫結合治療缺血性腦血管疾病的獨特優勢,腦泰通組方的中藥材均為常見藥物,方便易得,價位合理,操作簡單,適于臨床進一步推廣,也為中西醫結合治療缺血性腦血管疾病提供了新的思路與方法。

利益沖突聲明:無。