川陳皮素通過激活SIRT1/FOXO3a信號來減輕腎缺血再灌注損傷

曹 雯 徐玉祥 范 麗 郭 潔 李 江 張九芝

(1 西安市中醫醫院,陜西中醫藥大學西安附屬醫院腎病科,西安,710077; 2 陜西中醫藥大學基礎醫學院,咸陽,712046; 3 西電集團醫院腎病科,西安,710077)

腎臟缺血再灌注損傷(Renal Ischemia Reperfusion Injury,RIRI)是指腎臟缺血并恢復血液供應后引起的一系列腎臟損傷,可導致腎功能障礙[1-2]。在缺血后,再灌注觸發了一系列的病理生理級聯反應,包括細胞內Ca2+的釋放、自由基和活性氧的過度產生、中性粒細胞的募集,這一系列反應加速了細胞損傷[3-4]。因此,抑制氧化應激和炎癥是減輕RIRI的有效途徑。川陳皮素(Nobiletin,NOB)是一種主要存在于柑橘類水果中的多甲氧基黃酮,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗阿爾茨海默病和帕金森病等活性[5-7]。據報道,NOB對腦缺血具有神經保護作用,其作用機制可能與上調核因子紅系2相關因子2(Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2,Nrf2)和血紅素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1),下調核因子κB表達有關[5]。NOB通過恢復受損的自噬流量來減輕大鼠急性心肌梗死后的不良心臟重構[8]。此外,NOB通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B,PI3K/AKT)信號通路減輕RIRI[9]。NOB通過抑制炎癥介質和調節誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)-內皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)表達對大鼠RIRI發揮保護作用[10]。上述結果說明NOB對RIRI具有保護作用,然而,具體的分子機制尚不清楚。

多條細胞信號通路參與了RIRI的發生發展[11-12]。組蛋白去乙酰化酶沉默信息調節因子1(Silent Information Regulator 1,SIRT1)是一種重要的代謝傳感器,可對細胞壓力、饑餓和熱量限制作出反應[13]。SIRT1的激活促進了調節線粒體生物發生的基因轉錄,從而維持能量和代謝穩態[14]。據報道,SIRT1是許多植物黃酮類化合物的主要靶點[15]。此類化學物質對SIRT1的激活可調節線粒體生物發生和線粒體自噬。此外,SIRT1使叉頭框蛋白O(Forkhead Box Protein O,FOXO)家族的成員(包括FOXO3a)脫乙酰化并影響其下游自噬途徑[16]。研究顯示,SIRT1及其下游自噬信號調節缺血再灌注誘導的損傷[17]。最近,DUSABIMANA等[18]報道,NOB通過激活SIRT1/FOXO3a介導的自噬和線粒體生物發生來減輕肝臟缺血再灌注損傷。然而,目前尚不清楚NOB在RIRI中的可能作用機制。因此,本研究旨在揭示NOB是否通過激活SIRT-1/FOXO3a來減輕RIRI。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 40只8周齡雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級Balb/c小鼠購自陜西醫藥控股集團生物制品有限公司[SCXK(陜)2018-001],體質量20～25 g。將小鼠飼養在標準SPF級環境下:恒溫(23±2)℃、恒濕(60±10)%和12 h光暗循環照明。飼養期間不限制飲食和飲水。所有小鼠預適應飼養1周后進行實驗。本研究已獲得西安市中醫醫院倫理委員會的批準(倫理審批號:2018XZYYD015),所有動物實驗操作均按照動物福利倫理要求執行。

1.1.2 藥物 川陳皮素(純度:98.25%,MedChemExpress公司,美國,批號:HY-N0155)。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色試劑(批號:G1120)、天狼星紅染色試劑(批號:G1471)均購自北京索萊寶科技有限公司。血清肌酐(Serum Creatinine,Cr,批號:C011-2-1)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN,批號:C013-1-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,批號:A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px,批號:A005-1-2)和丙二醛(Malondildehyde,MDA,批號:A003-1-2)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。TUNEL試劑盒(Roche,瑞士,批號:11684817910),RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所,批號:P0013B)。Pierce BCA蛋白分析試劑盒(批號:23225)、Trizol試劑(批號:10296010)均購自美國Thermo Fisher Science。SIRT1(批號:ab110304)、FOXO3a(批號:ab109629)、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2關聯X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)(批號:ab32503)、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)(批號:ab182858)、微管相關蛋白輕鏈3(Light Chain-3,LC3)(批號:ab192890)、p62(批號:ab211324)、β-actin(批號:ab8227)、一抗及辣根過氧化物酶偶聯的二抗(批號:ab205719)均購自英國Abcam。高容量cDNA反轉錄試劑盒(批號:4374967)、Power SYBR? Green Master mix(批號:4367659)、StepOneTMReal-Time PCR System(批號:4376357)均購自美國Applied Biosystem。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理 NOB和SIRT1抑制劑EX527均使用0.1%二甲基亞砜溶解。將小鼠分為5組:假手術組、模型組、NOB組、EX527組、NOB+EX527組,每組6只。在建模前24 h,假手術組和模型組小鼠腹腔注射200 μL 0.1%二甲基亞砜溶劑,NOB組小鼠腹腔注射200 μLNOB(50 mg/kg),EX527組小鼠腹腔注射200 μL的SIRT1抑制劑EX527(5 mg/kg),NOB+EX527組小鼠腹腔注射100 μLNOB(50 mg/kg)和100 μL EX527(5 mg/kg)。

1.2.2 RIRI小鼠模型的建立 術前對小鼠禁食禁水處理24 h,小鼠腹腔注射75 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉。備皮及碘伏消毒后,雙側背部入路切口,分離出小鼠左側腎臟,用無損傷顯微血管夾夾住左腎動靜脈,阻斷左腎血流。然后游離右側腎臟,結扎腎蒂并切除右側腎臟,縫合皮膚切口。左側腎臟缺血40 min后腎臟表面變成黑紅色,然后松開左腎血管夾恢復左腎血液灌注,并縫合傷口。假手術組(Sham)小鼠僅開腹但不阻斷腎臟血流。

1.2.3 血清Cr和BUN水平的檢測 建模24 h后小鼠眼眶后靜脈叢取血,室溫下1 000×g離心15 min,取上清液。按照試劑盒的說明檢測血清中Cr和BUN的水平。

1.2.4 腎臟組織中氧化應激生物標志物的檢測 取血后斷頭處死小鼠并分離左腎,磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered Saline,PBS)沖洗,將一部分腎組織與100 mmol/L的trisPBS混合并制備勻漿,4 ℃下12 000 r/min離心10 min。按照試劑盒的說明檢測SOD、GSH-Px和MDA含量。

1.2.5 組織病理學分析 分離左腎后,將一部分腎組織用10%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm切片,通過HE染色觀察腎臟結構和形態學改變。天狼星紅染色檢測膠原沉積,通過分析腎臟切片中紅色染色面積的百分比來計算纖維化面積。

1.2.6 細胞凋亡檢測 將小鼠腎組織置于4%多聚甲醛中固定24 h。常規脫水、透明、石蠟包埋、切成5 μm石蠟切片。脫蠟水合后,在PBS中漂洗3次,5 min/次,切片用透析液(0.1%Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉)在4 ℃孵育10 min,在PBS中洗滌漂洗3次,5 min/次,然后用50 μL的脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick-end Labeling,TUNEL)試劑在37 ℃下避光孵育60 min。用PBS漂洗3次,5 min/次,然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色細胞核2 min。隨機取6個視野計數100個細胞中的TUNEL陽性凋亡細胞數。TUNEL陽性率=TUNEL陽性細胞數/計數細胞總數×100%。

1.2.7 蛋白質免疫印跡法檢測 小鼠腎組織在含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)緩沖液中在冰上裂解30 min。在4 ℃下15 000×g離心15 min后,將上清液用Pierce BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白裂解產物并轉移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后,將膜與抗SIRT1(1∶1 000稀釋)、FOXO3a(1∶1 000稀釋)、抗凋亡蛋白Bax(1∶3 000稀釋)、抗凋亡蛋白Bcl-2(1∶2 000稀釋)、微管相關蛋白LC3(1∶2 000稀釋)、p62(1∶3 000稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)在4 ℃下過夜孵育。然后將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h。之后使用電化學發光(Electrochemiluminescence,ECL)試劑顯影,β-actin用作內部對照。采用Image J軟件對相關蛋白表達進行定量分析。

1.2.8 實時熒光定量PCR檢測 采用Trizol法提取腎組織總RNA。根據高容量cDNA反轉錄試劑盒合成cDNA。使用Power SYBR? Green Master mix和StepOneTMReal-Time PCR System進行實時熒光定量PCR。反應條件:95 ℃預變性4 min,95 ℃變性60 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,40個循環。以β-actin為內參,采用2-△△Ct法計算相對表達量。引物序列如下:SIRT1,上游為5′-ACCAAATCGTTACATATTCC-3′,下游為5′-CAAGGGTTCTTCTAAACTTG-3′。FOXO3a,上游為5′-CTGTCCTATGCCGACCTGATCAC-3′,下游為5′-CATTCTGAACGCGCATGAAGCG-3′。β-actin,上游為5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′,下游為5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。

2 結果

2.1 NOB減輕RIRI小鼠腎組織病變 HE染色顯示,假手術組小鼠腎組織形態正常。模型組小鼠腎組織出現胞漿空泡、血管變性、炎癥細胞浸潤、腎小管細胞腫脹和腎小管壞死等病變。NOB組小鼠腎組織病變較模型組明顯減輕。NOB+EX527組小鼠腎組織病變較NOB組明顯加重。見圖1。

微波介質材料的研究主要采用諧振法和網絡參數法測量被測物品的介電常數.常見易燃有機液體與水的介電常數差異較大，如表1所示.

圖1 各組小鼠腎組織比較(HE染色,×400)

天狼星紅染色顯示,紅色染色區域為膠原,代表纖維化;黃色染色區域為肌肉纖維。假手術組腎組織紅色染色面積較小。模型組腎組織紅色染色面積較假手術組增多。NOB組腎組織紅色染色面積較模型組減少。NOB+EX527組腎組織紅色染色面積較EX527組減少。定量分析顯示,各組小鼠腎臟纖維化面積差異有統計學意義(F=288.155,P<0.001)。與假手術組比較,模型組小鼠腎臟纖維化面積顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,NOB組腎臟纖維化面積顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05)。與NOB組比較,NOB+EX527組腎臟纖維化面積顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠腎組織纖維化

2.2 NOB降低RIRI小鼠血清Cr和BUN水平 各組小鼠血清Cr和BUN水平差異有統計學意義(F=334.727,P<0.001;F=526.795,P<0.001)。與假手術組比較,模型組血清Cr和BUN水平顯著升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較,NOB組血清Cr和BUN水平顯著降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。此外,與NOB組比較,NOB+EX527組血清Cr和BUN水平顯著升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清Cr和BUN水平

2.3 NOB提高RIRI小鼠腎組織抗氧化活性 各組小鼠腎組織SOD、GSH-Px和MDA水平差異有統計學意義(F=36.757,P<0.001;F=188.613,P<0.001;F=169.249,P<0.001)。與假手術組比較,模型組腎組織SOD和GSH-Px水平顯著降低,而MDA升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較,NOB組腎組織SOD和GSH-Px水平顯著升高,而MDA降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與NOB組比較,NOB+EX527組腎組織SOD和GSH-Px水平顯著降低,而MDA升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腎組織中SOD、GSH-Px和MDA比較

2.4 NOB抑制RIRI小鼠腎組織中的細胞凋亡 與假手術組比較,模型組TUNEL陽性率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,NOB組TUNEL陽性率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。此外,與NOB組比較,NOB+EX527組TUNEL陽性率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)。假手術組腎組織TUNEL陽性染色(綠色熒光)較少。模型組腎組織TUNEL陽性染色較假手術組增多。NOB組腎組織TUNEL陽性染色較模型組減少。NOB+EX527組腎組織TUNEL陽性染色較EX527組減少。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織TUNEL陽性率比較

與假手術組比較,模型組Bax蛋白相對表達量顯著升高,而Bcl-2顯著降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較,NOB組Bax蛋白相對表達量顯著降低,而Bcl-2顯著升高(均P<0.05)。此外,與NOB組比較,NOB+EX527組Bax蛋白相對表達量顯著升高,而Bcl-2顯著降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖4。

圖4 各組小鼠腎組織中Bax和Bcl-2蛋白表達比較

圖5 各組小鼠腎組織中SIRT1和FOXO3a的mRNA表達水平比較

與假手術組比較,模型組SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量顯著降低,而p62顯著升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。與模型組比較,NOB組SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量顯著升高,而p62顯著降低,差異均有統計學意義(均P<0.05)。此外,與NOB組比較,NOB+EX527組SIRT1、FOXO3a和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量顯著降低,而p62顯著升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖6。

圖6 各組小鼠腎組織中SIRT1、FOXO3a、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的蛋白表達水平比較

3 討論

缺血再灌注可導致腎臟出現強烈炎癥和氧化應激反應,引起腎功能喪失[19]。因此,抑制過度的炎癥和氧化應激是預防和治療RIRI的關鍵。天然植物藥在抗炎和抗氧化中具有良好效果。NOB的抗炎、抗氧化活性已經被廣泛報道[5-7]。本研究中,HE染色和天狼星紅染色顯示,NOB減輕了RIRI小鼠腎組織病變并抑制了腎臟纖維化。Cr和BUN在RIRI動物中升高[20],提示腎功能發生障礙,另外,本研究表明NOB降低了RIRI小鼠血清Cr和BUN水平。與LIU等[9]研究報道,NOB降低了RIRI大鼠血清Cr和BUN水平,本研究與該研究結果一致。

腎細胞對氧分壓的變化非常敏感,其內源性抗氧化防御強烈依賴于高濃度抗氧化酶的存在,如SOD、CAT和GSH-Px[21]。研究表明,在動物模型中,即使延遲給予自由基清除劑也能減輕RIRI。活性氧的過量產生破壞了內源性抗氧化防御,導致ATP耗竭,膜磷脂蛋白酶活性升高,細胞內Ca2+水平升高,線粒體氧化磷酸化改變[22]。此外,氧自由基增加了損傷膜的脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA的氧化損傷[23]。在本研究中,RIRI小鼠腎組織中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低,而脂質過氧化產物MDA水平升高。NOB有助于抗氧化酶活性的恢復和抑制脂質過氧化。ZHANG等[5]研究也顯示NOB可顯著增加腦缺血大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、SOD1和GSH的表達。GüVEN?等[10]研究顯示NOB降低了RIRI大鼠腎組織中MDA、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-6水平。這些結果與本研究一致。充分證實NOB對RIRI小鼠具有良好的抗氧化作用。

此外,線粒體功能障礙是IR損傷的一個主要特征,因為線粒體對能量穩態非常重要,并直接介導氧化應激和細胞死亡[24]。過度的氧化應激可導致線粒體功能障礙并啟動細胞凋亡[25]。在本研究中,NOB減輕了RIRI小鼠的腎細胞凋亡,與LIU等[9]研究結果一致。這些結果提示,NOB可能通過抑制氧化應激,從而減輕了RIRI小鼠線粒體功能障礙以及隨后的細胞凋亡。

增加自噬和線粒體功能是減輕IR損傷的一種有前途的治療策略。SIRT1/FOXO3a信號通路是一條重要的自噬調節通路[18]。SIRT1在細胞能量代謝、衰老、自噬等許多生理過程中起著重要作用[26]。FOXO家族調節各種器官的自噬,通過激活小鼠肝臟和原代肝細胞中的FOXO3a表達增加自噬相關基因的表達[27]。FOXO3a活性受SIRT1的調節[28]。LC3和p62是2種主要的自噬調節蛋白。自噬時,胞漿型LC3(LC3Ⅰ)會發生酶解并轉變為自噬體膜型(LC3Ⅱ),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的大小可反映自噬水平的強弱[29-30]。p62是一種泛素結合蛋白,自噬發生后,p62與泛素化蛋白質結合,并在自噬溶酶體內降解,因此,p62的水平與自噬負相關[29-30]。SIRT1/FOXO3a信號通路對自噬的調控作用主要是通過調節LC3、p62等自噬相關蛋白來實現的。天然化合物(二氫楊梅素或小檗堿)通過增強SIRT1/FOXO3a誘導的自噬途徑來減輕肝臟IR損傷,而抑制FOXO3a或SIRT1的表達減弱了這些化合物的保護作用[31-32]。本研究顯示,NOB激活了RIRI小鼠腎組織SIRT1/FOXO3a信號通路并增強了腎細胞自噬。WU等[8]研究也顯示NOB增強了急性心肌梗死大鼠心肌組織中的自噬通量。另外,使用SIRT1抑制劑EX527處理來抑制小鼠體內SIRT1的表達,研究表明,SIRT1抑制劑EX527逆轉了NOB對RIRI小鼠的腎保護作用。因此,上述結果提示NOB通過激活SIRT-1/FOXO3a信號通路介導的自噬來減輕RIRI。

綜上所述,本研究表明NOB通過激活SIRT1/FOXO3a信號通路介導的自噬來減輕RIRI。本研究將有助于揭示NOB在治療RIRI中的具體機制,并且為RIRI防治藥物的開發提供參考。

利益沖突聲明:無。