一株長(zhǎng)頸鹿金黃色葡萄球菌感染的分離鑒定

周飄，湯德元，曾智勇，陳旭，袁盛林，廖正波，毛茵茗，何松

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

最近幾年來(lái)葡萄球菌感染現(xiàn)象急劇升高引起人們的廣泛關(guān)注，自然環(huán)境中極為廣泛地分布著葡萄球菌，細(xì)菌能透過(guò)多個(gè)途徑傳染，裂開(kāi)、受損皮膚，黏膜是主要的入侵途徑。嚴(yán)重時(shí)可造成菌血癥、敗血癥。在葡萄球菌屬中，金黃色葡萄球菌是一種最主要的病原體，它容易引起血管內(nèi)感染、壞死性肺炎、心內(nèi)膜感染等各內(nèi)臟器官的嚴(yán)重感染。而此例長(zhǎng)頸鹿感染金黃色葡萄球菌后表現(xiàn)的癥狀不明顯，出現(xiàn)突發(fā)性死亡。

長(zhǎng)頸鹿：一種非洲的反芻偶蹄動(dòng)物，拉丁語(yǔ)的意思是“身上有豹子斑點(diǎn)的駱駝”。它是目前世界上最大的陸生動(dòng)物，生活在非洲熱帶、亞熱帶稀樹大草地上。貴州野生動(dòng)物園內(nèi)，一只長(zhǎng)頸鹿在2022 年5 月中旬突然死亡，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)的改變，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，明確長(zhǎng)頸鹿死因可為長(zhǎng)頸鹿的疾病預(yù)防和以后的繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州省貴陽(yáng)市扎佐野生動(dòng)物園病死長(zhǎng)頸鹿的肺、心、肝、腸道和腎臟等組織。

1.2 剖檢

對(duì)病死長(zhǎng)頸鹿病理解剖，觀察肺、心、肝、腸道、胰腺、腎和其他組織的病理變化。

1.3 細(xì)菌分離純化及鏡檢

利用超凈臺(tái)，使用無(wú)菌接種環(huán)于病死長(zhǎng)頸鹿的心、肝、肺、腸道、胰腺和腎臟等處取樣，樣品在TSA 固態(tài)培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上做“Z”字劃線培養(yǎng)，然后在37℃下?lián)u床，24 小時(shí)后把TSA 固態(tài)培養(yǎng)基中的單菌落移入FTG 固態(tài)培養(yǎng)基（可從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購(gòu)買），把培養(yǎng)基放入37℃的水浴搖床中，在搖床上過(guò)夜，并每24 小時(shí)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，觀察并記錄金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)變化情況，之后吸取細(xì)菌菌液涂片，使用酒精燈外焰干燥固定，革蘭氏染色法染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)及染色

使用無(wú)菌接種環(huán)采集肝、肺、胰腺、腎進(jìn)行需氧和厭氧的血平板和LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48小時(shí)，可觀察到大量菌落生長(zhǎng)，使用革蘭氏染色法對(duì)單菌落染色，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

利用超凈工作臺(tái)，參考說(shuō)明書，使用細(xì)菌基因DNA 萃取試劑盒（可從北京天根生化科技有限公司購(gòu)買），提出一種菌液DNA，可用于16S rDNA PCR 擴(kuò)增的模板，依據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)合成16S rDNA 基因序列引物。16S rDNA 引物27F:5′-3′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R: 5′-3′GGTTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增的基因片段大約是1 500 bp。采用以下PCR 反應(yīng)體系擴(kuò)增16S rDNA 基因的目的片段，如下：分別為1 微升上游引物和1 微升下游引物，2 微升細(xì)菌DNA，21 微升mix 合成完整的整個(gè)25 微升體系。PCR 預(yù)變性反應(yīng)溫度：98℃，時(shí)間：10 分鐘；98℃變性，時(shí)間：30秒；50℃退火，時(shí)間：30 秒；72℃延伸，時(shí)間：1 分鐘；完成35 個(gè)循環(huán)；在72℃下，最后再延伸10 分鐘。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，按照說(shuō)明書上的步驟，用膠回收工具將PCR 產(chǎn)物中的目標(biāo)條帶提取出來(lái)，并送往擎科生物進(jìn)行序列測(cè)定。取5微升膠回收產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)提取的產(chǎn)物進(jìn)行了初步的鑒定，并在-20℃冰箱保存。

圖1 血平板厭氧培養(yǎng)結(jié)果

圖2 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

1.6 細(xì)菌的生化特性鑒定

參考細(xì)菌的生化鑒定管說(shuō)明書按步驟操作（購(gòu)買方式-青島海博生物技術(shù)有限公司），利用超凈工作臺(tái)，將經(jīng)過(guò)篩選和提純的細(xì)菌溶液接種在生化鑒定試管上，進(jìn)行測(cè)定，分別有葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、蔗糖、木糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖、丙二酸鹽、肌醇、西蒙氏枸櫞酸鹽、尿素、β-半乳糖苷(ONPG)、七葉苷、水楊素、葡萄糖磷酸鹽胨水、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖銨、葡萄糖酸鹽、賴氨酸脫羧酶、綿子糖、苯丙氨酸、明膠、硫化氫、硝酸鹽、氰化鉀、半乳糖生長(zhǎng)試驗(yàn)管等，將其放置在37℃的培養(yǎng)箱中，24 小時(shí)后，對(duì)其進(jìn)行觀察并將其結(jié)果記錄下來(lái)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

在TSA 平板上均勻涂覆分離純化的金葡菌，選擇一系列藥敏紙片：麥迪霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、利福平、新霉素、大觀霉素、頭孢氨芐、林可霉素、阿莫西林、新生霉素、青霉素G、恩諾沙星、呋喃唑酮、卡那霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等藥物（購(gòu)買方式--杭州微生物試劑有限公司），將藥物敏感紙附著在固態(tài)培養(yǎng)基上，并標(biāo)注出藥物敏感的種類，具體的操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行，將含有藥物敏感紙片的培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行無(wú)氧培養(yǎng)，24～48 小時(shí)后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果表明，該長(zhǎng)頸鹿感染金黃色葡萄球菌，癥狀疑似金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的TSST （中毒性休克綜合征毒素）導(dǎo)致長(zhǎng)頸鹿中毒性休克綜合征，該病毒因子可通過(guò)增加內(nèi)毒素的敏感性，引起心血管絮亂而休克死亡。

2.1 剖檢結(jié)果

病死長(zhǎng)頸鹿皮下無(wú)出血點(diǎn)，胃膜正常，腸系膜無(wú)出血點(diǎn)，腹腔無(wú)積液，腸端無(wú)脹氣，脾臟無(wú)病變，肺部瘀血并伴出血點(diǎn)、出現(xiàn)間質(zhì)性水腫和肺泡性水腫，心臟存有心包積液，由于病鹿長(zhǎng)期臥地不起，關(guān)節(jié)腫大，觸摸四肢有波動(dòng)感，關(guān)節(jié)液增加，呈化膿性關(guān)節(jié)炎。

2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察

培養(yǎng)24～48 小時(shí)后，LB 培養(yǎng)基大量菌落生長(zhǎng)，用革蘭氏染色法對(duì)分離和提純的細(xì)菌進(jìn)行染色，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌呈球狀（見(jiàn)圖3），直徑約1微米，多個(gè)球菌不規(guī)則地堆在一起，形似葡萄串，初步鑒定為金黃色葡萄球菌。

圖3 菌落鏡檢染色結(jié)果

2.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以純化細(xì)菌基因組為模板，用16S rDNA 特異性引物對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳方法，得到大約1500 bp 的目標(biāo)條帶（圖4），和目標(biāo)片段的序列長(zhǎng)度大致相同。將PCR 得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后于NCBI 中，用BLAST 進(jìn)行比較分析，測(cè)序得到的結(jié)果表明：此序列與GenBank 中的金黃色葡萄球菌16S DNA 基因序列同源性高達(dá)100% ，證實(shí)其為金黃色葡萄球菌。

圖4 PCR電泳結(jié)果

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

其結(jié)果是：該菌株對(duì)蔗糖、葡萄糖等反應(yīng)呈陽(yáng)性, 對(duì)明膠、棉子糖等反應(yīng)呈陰性（表1）。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果表明：環(huán)丙沙星、麥迪霉素、利福平、萬(wàn)古霉素抗菌區(qū)直徑普遍大于20 毫米（表2），說(shuō)明上述藥物對(duì)金葡菌有很好的抑菌效果。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

采用細(xì)菌分離鑒定，生化檢測(cè)，PCR 技術(shù)及藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)該病例進(jìn)行了研究，分離純化得到一株金黃色葡萄球菌。葡萄球菌屬在自然界中分布廣泛，人和動(dòng)物的帶菌率很高，污水、土壤、空氣、塵埃都有葡萄球菌存在，而且，這種細(xì)菌對(duì)環(huán)境沒(méi)有任何特殊的要求，很難清除。葡萄球菌屬共有28 個(gè)種，有些種能對(duì)人畜造成嚴(yán)重感染，是一種能引起食物傳播疾病的動(dòng)物和人的共患病原。葡萄球菌共有兩種分型，分別為生物學(xué)分型和表型標(biāo)記分型。金葡菌在葡萄球菌屬中是一種重要的致病菌，金葡菌引起的感染主要是由于其含有血漿凝固酶。通過(guò)該病例的臨床癥狀、解剖病理學(xué)改變及實(shí)驗(yàn)室病原菌的分離培養(yǎng)，確診長(zhǎng)頸鹿為金黃色葡萄球菌感染所致。因?yàn)檫@種菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類和頭孢類的藥物有廣泛的抗性，對(duì)氨基糖苷類的藥物有中等的敏感，也有部分的耐藥，因此，在治療時(shí)，應(yīng)盡可能的少用這兩種藥物。

金黃色葡萄球菌是一種非常常見(jiàn)的人類致病菌，可以引起皮膚、軟組織的感染，以及致命性肺炎、骨髓炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎等。另外，按照對(duì)抗生素藥物敏感程度，金葡菌可分為耐甲氧西林金葡菌（MSSA）與耐甲氧西林金葡菌（MRSA）兩種。近年來(lái)，隨著細(xì)菌的進(jìn)化，抗生素的濫用，金葡菌的耐藥性一直在增強(qiáng)，全球范圍內(nèi)，MRSA感染率上升，MRSA 抗感染臨床治療難度加大。

本次野生動(dòng)物園梅花鹿發(fā)生金黃色葡萄球菌感染，主要是該長(zhǎng)頸鹿感染金黃色葡萄球菌。長(zhǎng)頸鹿圈舍沒(méi)有定期進(jìn)行殺菌消毒，導(dǎo)致長(zhǎng)頸鹿自身免疫力有所下降，同時(shí)又食入了環(huán)境中污染的金黃色葡萄球菌，在其體內(nèi)從而導(dǎo)致發(fā)病。防制措施主要為立即將病死長(zhǎng)頸鹿妥善處理，打掃圈舍衛(wèi)生，采取相應(yīng)應(yīng)急措施采取及時(shí)，長(zhǎng)頸鹿群中并未再發(fā)生病例。