大腸桿菌O139 誘導小鼠細菌性腹瀉模型的構建

張莉，王佳，豆思遠，高軍軍，李勇生

（甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730046）

仔豬水腫病是斷奶仔豬一種常發性細菌性疾病，近年來發病率逐年增高，發病率在10%～20%，死亡率極高，嚴重影響了經濟效益。產志賀毒素大腸桿菌（STEC）是引起豬水腫主要病原菌，其中以O 抗原群O139 最為常見，由于血清型眾多、致病因子復雜多變，導致缺乏有效治療藥物，疫苗研發也進展緩慢。本實驗以大腸桿菌O139 誘導小鼠細菌性腹瀉模型的構建，探索大腸桿菌O139 在感染小鼠體內的動態分布，和各器官組織的病理學變化，為研究該菌的感染機制、建立病理學、病原學等診斷方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和菌種

實驗動物選用18～22 克，6～8 周齡C57BL/6小鼠280 只，雌雄各半。小鼠自由采食和飲水，飼養于蘭州大學實驗動物中心SPF 屏障環境內，飼喂SPF 鼠料購于北京科澳協力飼料有限公司；飲水經杭州潔達凈化科技有限公司生產的實驗動物飲用水處理器處理；所用墊料高壓滅菌，每周更換2 次，換完墊料后用84 消毒液等對飼養室進行消毒，每周紫外線照射1 次。

C57BL/6 小鼠臟器系數

大腸桿菌(E.coli:O139)由甘肅農業大學動物醫學院微生物實驗室提供。

1.2 菌種活化及濃度測定

實驗前將保存的E.coli:O139 接種于普通瓊脂斜面培養基上活化，然后接種于無菌新鮮肉湯2 毫升中，37 ℃24 小時后，取菌液2 毫升擴培于無菌普通營養肉湯20 毫升中，37 ℃18 小時后，經活菌計數和比濁法測定，使用時稀釋成不同濃度，計數后距感染時間不宜超過2 小時。

1.3 感染途徑和劑量確定

經預實驗確定感染途徑和感染劑量。禁食不禁水12 小時后，小鼠隨機分5 組，每組12 只，雌雄各半，分籠飼養。第1 組小鼠腹腔注射0.2毫升約1.5×108CFU；第2 組灌胃接種0.2 毫升菌液約1.5×108CFU；第3 組鼻腔滴注濃縮菌液1～2 滴約1.5×108CFU；第4 組尾靜脈注射0.2 毫升菌液約1.5×108CFU；第5 組設對照，腹腔注射0.2 毫升生理鹽水。定期觀察小鼠精神狀況、食欲、行為、糞便等臨床癥狀，剖解自然死亡和脫頸致死的小鼠從組織臟器中分離該菌。

在確定感染途徑后，禁食不禁水12 小時后，小鼠隨機分組，每組12 只，雌雄各半，分籠飼養。距籠底2～3 厘米處放置6 毫米×6 毫米鋁網，并在籠底層放置102 中速定性濾紙，每小時換一次濾紙。按每10 克體重0.2 毫升給菌，采用相同容積不同濃度感染。

1.3.1 最小致死量和半數致死量(LD50)的確定

按照1.1 倍梯度稀釋，設計劑量分組為1.79×108CFU/毫升、1.63×108CFU/毫升、1.48×108CFU/毫升、1.35×108CFU/毫升、1.23×108CFU/毫升、1.12×108CFU/毫升、1.02×108CFU/毫升、0.93×108CFU/毫升、0.85×108CFU/毫升，連續觀察10 小時。采用加權回歸法計算半數致死量(LD50)和最小致死量。

1.3.2 半數感染量和最小感染量確定

根據半數致死量(LD50)和最小致死量，以組距1.1 倍設計劑量分組，選擇實驗小鼠生命安全的的最低菌液濃度即最小感染量為試驗注射濃度。

1.4 腹瀉模型的復制

選擇實驗小鼠生命安全的的最低菌液濃度即最小感染量為試驗注射濃度，選取20 只小鼠復制腹瀉模型，并設立健康對照組。連續觀察5天，觀察感染后小鼠臨床癥狀、體重變化、血液生化指標、病理變化、臟器重量、臟器系數等。記錄總便數、稀便數、腹瀉指數（DI）和稀便級。分別稱取模型組和對照組小鼠體重后，從眶后靜脈竇采血分離血清，檢測ALT（谷丙轉氨酶）、AST（谷草轉氨酶）、AST/ALT （谷草轉氨酶/谷丙轉氨酶）、TP（總蛋白）、ALB（白蛋白）、GLO（球蛋白）、A/G（白蛋白／球蛋白）、ALP（堿性磷酸酶）、GLU（葡萄糖）、BUN（尿素）、CREA（肌酐）、BUN/CR（尿素/肌酐）、CHO（膽固醇）、TG（甘油三酯）、IBIL（間接膽紅素）等15 項指標。解剖觀察病理變化，依次取出心、肝、脾、肺、腎，用濾紙吸去各臟器表面的血液后稱取濕重，計算臟器系數。并涂片鏡檢，進行細菌培養分離和生化鑒定。統計分析，數據描述以x±s 表示；品系間用單因素方差分析；兩樣本用t 檢驗。

2 結果

2.1 不同感染途徑的比較

灌胃感染組和鼻腔滴注感染組在預試中最高劑量1.5×108CFU/毫升，仍未致病，大便培養也未見該菌生長；尾靜脈接種在預試中臨床表現不顯著，大便培養不穩定。腹腔注射組在所設計的劑量范圍內呈梯度發病和死亡，大便細菌培養均呈陽性。結果表明，腹腔注射誘導動物腹瀉模型是比較可行的方法，感染小鼠的各個臟器發生了病理變化。

2.1.1 腹腔感染途徑

在接種2 小時后，小鼠都出現扎堆，被毛粗亂，精神萎靡，行動遲緩，喪失正常的跳躍、爬籠行為。部分小鼠在接種3～4 小時后表現出腹瀉癥狀，持續4～5 小時；6 小時后眼角出現粘性分泌物，9 小時后，呼吸減弱，不停抽搐；10 小時后，睫毛反應消失，但仍不停抽搐。在接種后的4 小時出現小鼠死亡，18～24 小時達到死亡高峰期，72 小時后不再出現小鼠死亡。

剖解可見：皮下呈彌漫性出血；脾臟明顯腫大，膽囊充盈；肝臟腫大，質地變脆；腸道內充滿黃色液體，部分小腸腸系膜腫大。有的小鼠胸腔積液，腦部有出血點。剖解自然死亡和脫頸致死的小鼠，可從小鼠的心、肝和脾中分離出該菌，并且這種情形可持續3 天，5 天后心、肝中很難再分離出該菌，脾臟中仍可分離出該菌。

2.1.2 灌胃感染途徑

接種后，28～32 小時后小鼠出現精神萎靡，食欲減退，活動減少，扎堆，大部分小鼠尿液顏色加深。死亡多發生在40～72 小時。剖解發現，死亡小鼠腹腔內有漿液性滲出，脾臟壞死，肝臟邊緣壞死，肺臟無明顯病變，腸道內充滿黃色液體。剖解死亡小鼠，可從小鼠的肝臟和脾臟中分離出接種菌，但5 天后肝臟和脾臟中很難分離出細菌，十二指腸中則可分離出該菌。

2.1.3 鼻腔感染途徑

接種后，小鼠出現一過性食欲降低，行動減少。數小時后，采食和行動恢復正常。未出現死亡，脫頸致死后，剖解可見個別小鼠脾臟腫大，其它器官組織未發生明顯病變。各內臟器官中未分離到該菌。

2.1.4 尾靜脈感染途徑

僅有1 只小鼠死亡，剖解出現敗血癥狀。同組其它小鼠各器官組織未發生明顯病變。從死亡小鼠的組織臟器中分離到該菌，其他小鼠各組織器官未發現該菌。

2.1.5 對照組

對照組小鼠無異常，正常采食、飲水，并有正常的跳躍和爬籠行為。

2.2 感染劑量的確定

2.2.1 最小致死量和半數致死量（LD50）的確定

使用加權回歸法計算半數致死量 （LD50）為0.93×108CFU/毫升。

2.2.2 半數感染量和最小感染量確定

選擇實驗小鼠生命安全的最低菌液濃度即最小感染量為最佳試驗注射濃度即0.58×108CFU/毫升，每10 克體重0.2 毫升腹腔注射。

2.3 腹瀉模型的復制

2.3.1 臨床癥狀

在接種30～60 分鐘后，所有小鼠均出現被毛粗亂，扎堆，精神沉郁，食欲減退，眼睛半瞇，行動遲緩，喪失正常的清理、跳躍、爬籠行為。3～4小時后開始出現腹瀉癥狀，持續4～5 小時，四肢和尾根處有糞便粘連，食欲廢絕；6 小時后眼角出現分泌物，初為無色稀薄粘性分泌物，后逐漸轉為白色粘稠分泌物，在18～24 小時白色粘稠分泌物可糊住眼睛四周，小鼠眨眼反應或對外界應激反應遲緩甚至消失；9 小時后，呼吸減弱，不停抽搐；10 小時后，睫毛反應消失，但仍不停抽搐，有個別小鼠出現神經癥狀，四肢呈游走狀，有的小鼠不停向一側轉圈。個別小鼠出現漸進性消瘦，被毛直立，毛色光澤降低。10～16 小時排便量和尿量減少，甚至幾乎無排泄物。小鼠牙關緊閉，身體重量明顯減輕，眼角有大量粘稠分泌物，尾巴和四肢末梢發紺，肛門周圍也沾有排泄物和墊料。

2.3.2 剖解觀察

剖解后，皮下呈彌漫性出血；肝臟腫大，質地變脆，肝臟表面有點狀出血點；膽囊充盈；脾臟腫大；腸道內充滿黃色液體，腸粘膜潮紅、腫脹，粘膜表面有大量的炎性滲出物。滲出物因病程發展有所不同，初期滲出物多呈水樣、雞蛋清樣的漿液狀，后因黏膜上皮細胞中的杯狀細胞分泌粘液增多從而導致滲出物粘稠，最終由于炎性細胞的侵潤和黏膜上皮細胞剝落導致滲出物變為膿液樣。腸壁淋巴小結呈堤壩樣隆起，嚴重時腸道粘膜面呈糜爛樣。

2.3.4 臟器重量和臟器系數變化（見下表）

測定小鼠(心、肝、脾、肺、腎)臟器系數進行統計學分析，模型組與對照組小鼠臟器系數相比差異顯著（P＜0.05），同時模型組各臟器相比對照組有明顯眼觀變化。結果表明，各臟器呈現不同程度的細胞腫脹、水腫、充血、出血、增生、肥大、腫大等病理變化時，導致該臟器的重量增加，各臟器未見脫水、萎縮、萎陷、壞死和腐離等病理變化，食欲下降或消化功能減弱等引起體重增長減慢和伴隨器官系數的相對增大。

2.3.5 血清生理指標

血液生理指標常作為毒理學實驗中的測評指標。本實驗中ALT、AST、AST/ALT、TP、ALB、GLO、A/G、ALP 都反映肝功能受損情況的指標。ALT 和AST 的升高反映肝細胞受損程度嚴重；TP 下降，ALB、GLO、A/G 減少表明肝臟炎癥嚴重；ALP 增加表明肝臟有炎癥或肝內膽汁淤積導致ALP 活力增加；BUN、CREA、BUN/CR 是衡量腎功能的指標。BUN 和CREA 的數值增加代表腎功能發生障礙；GLU 是血液中血糖濃度的一項指標，GLU 降低；CHO 和TG 是衡量血液中血脂水平的指標，CHO 和TG 升高，同對照組相比，上述相應指標差異顯著（P＜0.05），表明對小鼠血液生理指標產生影響。

2.3.6 病理組織學變化

小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸組織在顯微鏡下均見異常。小鼠心肌纖維橫紋可見，間質無水腫和炎性細胞浸潤，但呈現出血現象；肝臟肝小葉結構不完整，肝細胞廣泛變性、水腫，肝臟充血、出血，表層部分肝細胞變性、壞死，可見廣泛性壞死灶(見圖A)；脾臟充血、出血，白髓受到紅細胞擠壓，發育不良，淋巴小結萎縮，白髓、紅髓及邊緣區結構不太清晰(見圖B)；腎臟表層腎小管上皮細胞變性壞死，腎臟充血、出血，腎小囊腔內有滲出物，腎曲小管上皮腫脹(圖C)；小腸粘膜組織學形態異常，固有層見炎性反應，腸粘膜腫脹，導致膽管開口處變得狹窄或閉鎖，膽汁排入腸管的量減少或缺乏，導致腸內細菌繁殖較快，引起病變，十二指腸腸絨毛脫落，溶解，腸道固有層有大量淋巴細胞侵潤(見圖D)；空腸的微絨毛脫落，局部腸絨毛斷裂，腸管充血，出血(見圖E)；回腸腸絨毛嚴重脫落，固有層嚴重充血(見圖F)；回腸HE×400：固有層嚴重充血，淋巴小結腫大(見圖G)；盲腸腸絨毛脫落嚴重，淋巴小結增大，固有層淋巴細胞增生(見圖H)；結腸腸絨毛幾乎全部脫落(見圖I)。

3 討論

A 肝臟HE×100：肝細胞廣泛變性、水腫，肝臟充血、出血，表層部分肝細胞變性、壞死，可見廣泛性壞死灶；B 脾臟HE×100：充血、出血，白髓受到紅細胞擠壓，發育不良，淋巴小結萎縮；C 腎臟HE×100：表層腎小管上皮細胞變性壞死，腎臟充血、出血；D 十二指腸HE×100：腸絨毛脫落，溶解，腸道固有層有大量淋巴細胞侵潤；E 空腸HE×100：微絨毛脫落，局部腸絨毛斷裂，腸管充血，出血；F 回腸HE×100：腸絨毛嚴重脫落，固有層嚴重充血；G.回腸HE×400：固有層嚴重充血，淋巴小結腫大；H 盲腸HE×100：腸絨毛脫落嚴重，淋巴小結增大，固有層淋巴細胞增生；I 結腸HE×100：腸絨毛幾乎全部脫落。

3.1 不同感染途徑的比較

鼻腔接種后，小鼠未出現臨床癥狀，組織臟器也未分離該菌，而且血清學檢測也未發現抗體，說明小鼠對鼻腔接種不易感。這與文獻報道的腸道菌不易通過呼吸道感染相一致。灌胃接種，要求接種劑量一定準確，存在傷及食管和誤入氣管的可能性，而且接種前未對胃酸進行預處理，這導致部分小鼠造模效果不理想。尾靜脈注射后，接種劑量偏小，細菌會被白細胞吞噬，小鼠不表現臨床癥狀；但如果接種劑量偏大，又會迅速造成小鼠死亡。腹腔注射，選擇劑量范圍相對廣泛而且易于操作。腹腔注射組在設計的劑量范圍內呈梯度發病和死亡，死亡時間都在注射后4～72 小時內，表現出急性死亡、神經癥狀和敗血癥狀，與自然發病仔豬、犢牛、雞等臨床癥狀和病理變化相同。本研究觀察發現小鼠發生最后死亡的時間為接種后3 天。未死亡小鼠并不表現出明顯的臨床癥狀，但剖解可見脾臟腫大。在腹腔注射相同接種劑量，小鼠出現的神經癥狀存在一定差異。這與文獻報道的腸道菌引起動物神經癥狀不穩定相一致，證實本研究采用的腹腔注射0.58×108CFU/毫升，可成功構建大腸桿菌O139 誘導小鼠腹瀉模型。

3.2 腹瀉模型的復制

豬水腫病是STEC 產生的F18 菌毛和Stx-2e 毒素等引起，通過菌毛介導的黏附作用，定植于腸上皮細胞并產生毒素，主要血清型為O139，該病發病率較低，但死亡率可高達90%以上。在不同條件下O139 定居于小腸上皮細胞有時既可引起斷奶仔豬腹瀉也可引起水腫病(PWECD/ED)，但目前對于該病的防控主要側重養殖場的生物安全管理和預后治療上，尚無理想的疫苗，尤其是2020 年國家全面禁止，對于替抗藥物的研發迫在眉睫。但目前國內外多數研究僅將菌毛和毒素抗原納入，缺乏有效的動物模型也是疫苗和藥物研發的一個阻力。

本實驗選用C57BL/6 鼠相比BALB/c 小鼠不易發生呼吸道感染及肺炎。大腸桿菌O139 誘導的腸粘膜充血和炎性刺激物的作用，使腸管的運動和分泌機能增強，引起腹瀉，排出水樣帶腥臭的糞便，導致大量水分和消化液中的鉀鈉離子或重碳酸鹽隨糞便流失，從而使機體脫水和代謝性酸中毒，使得動物的食欲下降或消化功能減弱等引起動物的體重增長減慢和伴隨器官系數的相對增大。大腸桿菌O139 構建的腹瀉模型空腸、回腸段腸絨毛嚴重脫落、溶解，本研究結果與上述文獻報道一致。感染O139 后，該菌的F18a、F18b 菌毛和小腸上皮細胞相應的受體結合，黏附于小腸絨毛并大量繁殖，并產成大量Stx2e 毒素被腸道吸收。Stx2e 作為一種血管毒素，損傷血管內皮細胞，導致血管通透性發生變化，出現水腫，有時壓迫腦部神經組織，臨床出現神經癥狀。

本試驗成功構建大腸桿菌O139 誘導小鼠腹瀉模型，研究結果為該病的診斷、預防和治療奠定了科學的理論基礎，并為相關藥物和疫苗研發提供了動物模型。