白花懸鉤子的葉片組培快繁與植株再生研究

覃春梅 李斌 傅鵬 盤涌 譚小明 姚紹嫦

摘要：為獲得一套完整高教的白花懸鉤子（Rubus leucanthus Hance）組培快繁技術體系，以葉片為外植體，系統研究了外植體不同滅菌時間、不同植物激素配比及濃度對愈傷組織誘導及叢生芽分化、增殖和生根的影響，并進行了組培苗移栽。結果表明：最佳的外植體滅菌方式為2% NaCIO溶液2 min+0.1% HgCI2溶液5min，實現了污染率最低（23.33%）、存活率最高（73.33%）；最佳的叢生芽分化誘導培養基為MS+3.0 mg．L-16-BA+0.5 mg.L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA，愈傷組織誘導率為100%，芽誘導率為93.33%；6-BA與KT對增殖系數有顯著影響，最佳的繼代增殖培養基為MS+2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA，培養20 d的增殖系數達7.84；最適的生根培養基為1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA，生根率為100%，移栽成活率為86.67%，實現平均株高3.02 cm、平均根長6.16 cm、平均根數8.67條與平均葉數2.47片。本研究結果既可為白花懸鉤子優質種苗的工廠化生產提供技術支持，又可為懸鉤子屬植物葉片組培快繁體系的建立提供參考依據。

關鍵詞：白花懸鉤子；葉片；組培快繁；植物激素；移栽

中圖分類號：S567.1+9：Q949.751.8 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0071-07

白花懸鉤子（Rubus leucanthus Hance）是薔薇科懸鉤子屬的落葉灌木，又名白鉤筋藤、南蛇筋，以根或果實入藥，分布于湖南、福建、廣東、廣西、貴州、云南等地，常見于低海拔至中海拔的疏林或曠野中。白花懸鉤子是一種傳統的壯瑤藥材，被廣泛收載于《藥用植物辭典》《中國中藥資源志要》《廣西中藥資源名錄》等中醫藥學文獻資料中。據《嶺南中草藥遷地保護圖譜》記載，白花懸鉤子味苦，性涼，具有利濕、解毒的功效，民間常用于治療腹瀉、赤痢口]。類似于同屬植物掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu），白花懸鉤子的果實成熟時呈紅色，味道酸甜可口，也是一種重要的功能性食品，營養豐富，可食用或藥用，常用于治療遺尿、腎虛、陽痿早泄、尿頻、遺精等疾病。雖然白花懸鉤子的化學成分尚未有相關的研究報道，但是懸鉤子屬植物的化學成分分析已有報道，可分為酚酸類、黃酮、三萜、揮發油、甾體和生物堿、多糖等類型。白花懸鉤子藥材目前仍以野生資源為主，隨著近年來生長環境惡化及人為采挖加劇，野生資源已日益枯竭，根本無法滿足醫藥市場的需求，開展人工種植前景廣闊、勢在必行。

在自然狀態下，白花懸鉤子主要依靠種子繁殖．但由于種子小、成熟果實常被鳥啄食、資源分布零散等因素，難以采收其種子進行人工繁殖。利用組織培養技術進行白花懸鉤子的種苗繁育，具有繁殖速度快、繁殖系數高、后代遺傳穩定性高等優點，可在短時間內獲得大量優質種苗，對白花懸鉤子種質資源保存與產業化生產具有重要意義。然而，目前尚未發現白花懸鉤子組培再生體系的相關研究報道。有關掌葉覆盆子、樹莓（Rubus idaeusL.）等同屬植物的組培快繁研究報道可為白花懸鉤子組培快繁體系的建立提供一定的參考依據。謝從壽等以掌葉覆盆子當年生莖段為外植體成功建立了組培快繁體系，分別在誘導培養基MS+1.5mg.L-1 6-BA+0.15 mg.L-1 NAA與增殖培養基MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA上實現了較高的誘導率（68％）與增殖系數（4.87）；最佳生根培養基為1/2MS+0.6 mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-IBA +0.8 mg·L-1活性炭，生根率達到95.3%，生根數達到5.7條，根長達到5.8 cm，根系發達，幼苗生長健壯。王利平等利用同樣的材料也成功建立了掌葉覆盆子的組培再生體系，獲得了更高的萌發率（>80％）與增殖系數（15.1），但使用了更低濃度的植物激素組合。徐亞英等以新生腋芽為外植體，著重探討了不同濃度的6-BA、NAA、IBA在樹莓離體快繁中的作用。

在懸鉤子屬植物的組培實驗中，通常選取的外植體材料是一年生帶芽嫩莖（單芽莖段）、莖尖或未萌發的腋芽，目前尚未發現使用葉片作為外植體材料來建立其組培快繁體系的研究報道。因此，本研究以白花懸鉤子葉片為外植體，篩選出外植體滅菌的最佳方法及愈傷組織誘導、叢生芽分化和增殖、生根的最佳培養基配方，建立了其離體快繁體系，以期為白花懸鉤子優質種苗的工廠化生產和懸鉤子屬植物葉片組培快繁體系的建立提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為白花懸鉤子（Rubus leucanthus Hance），取自廣西中醫藥大學科研種植基地，于晴天上午選擇生長健壯、無病蟲害的白花懸鉤子植株，剪取嫩葉帶回實驗室。

1.2試驗方法

1.2.1外植體滅菌處理 將白花懸鉤子的嫩葉放入燒杯中，經0.05％的洗潔精水浸泡15 min后，流水沖洗30 min，然后在超凈工作臺上用不同的外植體滅菌方法（表1）進行滅菌；用無菌水浸洗滅菌后的嫩葉3-5次，再用無菌濾紙吸干表面水分，用滅菌解剖刀將嫩葉切成1 cm2左右的小塊接種到初代誘導培養基上誘導愈傷組織與叢生芽。每個處理接種30瓶，每瓶接種1塊葉片，3次重復，共90瓶。培養10 d，觀察記錄外植體的污染情況。

1.2.2初代誘導培養 以MS為基本培養基，添加不同質量濃度的6-BA、KT與NAA組合，并附加3.0％的蔗糖和0.5%的瓊脂，調pH 6.0，配制成不同的初代誘導培養基（表2）。將葉片接種到不同的培養基上，每處理接種10瓶，每瓶接種3塊葉片，重復3次，然后在（26±2）℃、光照強度2 000 lx、光照時間10 h/d的條件下培養30 d，觀察記錄愈傷組織誘導與叢生芽分化情況，以篩選出最佳的初代誘導培養基。

1.2.3繼代增殖培養 待初代培養的叢生芽長至1.5-2.0 cm時，選擇生長一致的單芽轉接至以MS添加不同激素濃度的繼代增殖培養基上，培養基附加3.0％蔗糖和0.5％瓊脂（pH 6.0），6-BA、KT、NAA添加濃度采用Lg（34）正交試驗設計方法進行篩選，因素與水平見表3。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個芽，重復3次。在與初代誘導培養相同條件下培養20 d，觀察記錄增殖系數及再生芽的生長情況，以篩選出最佳的繼代增殖培養基。

1.2.4生根培養 當繼代增殖無菌苗長至1.5cm以上，從基部切下單個芽，接種至以1/2MS添加不同生長素的生根培養基中（表4），培養基附加3.0%蔗糖和0.5%瓊脂，pH 6.0。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個芽，重復3次。在（26±2）℃、光照強度1 000 lx、光照時間8 h/d條件下培養20 d，觀察記錄每個處理的生根情況，統計生根率、平均株高、平均根長、平均根數與平均葉數，以篩選出最佳的生根培養基。

1.2.5組培苗移栽 選取生長健壯、根系良好的組培苗，在自然光下馴化煉苗7d，然后打開瓶蓋繼續煉苗3～5 d，用鑷子將組培苗輕輕從培養瓶中取出，用流水沖洗干凈根部殘留的培養基，移栽到裝有混合基質的育苗杯中，混合基質為泥炭土+珍珠巖（體積比為3：1）；用塑料薄膜覆蓋7d，之后揭開薄膜，在室內自然條件下繼續培養。移栽后20 d，觀察統計組培苗的移栽成活率。

1.3數據處理與統計分析

污染率（%）=（污染的外植體數／接種的外植體數）×100：

存活率（%）=（誘導出愈傷組織或叢生芽的外植體數／接種的外植體數）×100：

增殖系數=高度大于1.0 cm的有效芽數／接種芽數；

生根率（%）=（生根的芽數／接種的芽數）×100；

平均根數=總生根條數／生根的組培苗數；

移栽成活率（%）=（成活的組培苗數／移栽的組培苗數）×100。

試驗數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS24.0軟件進行處理分析，結果以平均值±標準差的方式表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVE）、Duncan's新復極差法進行多重比較。以P<0.05為差異具有統計學意義，表中的小、大寫英文字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。

2結果與分析

2.1不同滅菌方法對外植體滅菌效果的影響

由表5可知，不同滅菌方法的外植體污染率與存活率存在顯著差異。單獨使用0.1% HgCI2或2qo NaCIO進行處理時，外植體的污染率均高于50％，存活率均低于50％，與兩者的組合處理相比存在極顯著差異。當使用0.1％HgCl2與2％NaCLO進行組合處理時，污染率均低于30%，存活率均高于50%。當滅菌處理為2％ NaClO溶液2min+0.1％ HgCl2，溶液5 min時，外植體的污染率較低（23.33%），存活率最高（73.33%）且極顯著高于其它處理。可見，當外植體在2% NaCLO溶液中滅菌2 min后繼續在0.1% HgCl2溶液中處理較短時間，可獲得較高的存活率，說明HgCl2可有效抑制外植體的污染，但滅菌時間過長容易對外植體造成毒害作用。綜合污染率與存活率，我們認為白花懸鉤子葉片最佳的滅菌方法為2% NaCIO溶液2 min+0.1% HgCl2溶液5min。

2.2不同植物激素種類與濃度對初代誘導培養的影響

由表6可知，不同激素種類與濃度配比的培養基均能使葉片誘導出愈傷組織，但叢生芽誘導率存在極顯著差異。當6-BA濃度為2.0 mg·L-1、NAA濃度為0.2 mg·L-1時，隨著KT濃度的逐漸升高，芽誘導率逐漸增加，變化范圍為36.67％-60.00％；當6-BA濃度為3.0 mg.L-1、NAA濃度為0.5 mg.L-1時，配合較低濃度的KT（0.5 mg·L-1），獲得了較好的叢生芽誘導效果，芽誘導率最高，達到93.33%，極顯著高于其它處理。因此，我們認為白花懸鉤子最佳的初代誘導培養基為MS+3.0mg.L-1 6-BA+0.5 mg.L-1 KT+0.5 mg.L-1 NAA。

2.3不同植物激素種類與濃度配比對繼代增殖培養的影響

由表7可知，不同植物激素種類與濃度配比的培養基對白花懸鉤子叢生芽的繼代增殖存在極顯著影響。當6-BA用量較低（1.5 mg·L-1）時，叢生芽的增殖系數隨著KT與NAA濃度增加而極顯著下降，此時叢生芽的生長情況不理想：若KT濃度過低，叢生芽的基部容易褐化，葉片容易變黃；若NAA的濃度過高，叢生芽容易長不定根。增加6-BA用量有利于獲得較強的叢生芽生長勢，6-BA、KT和NAA三種激素組合使用可獲得較好的叢生芽增殖效果與生長狀況，在2.5 mg·1-1 6-BA+1.5mg.L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA處理下叢生芽的增殖系數較高，生長勢強且葉片保綠較好。

從正交試驗的結果來看，在添加2.5 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA的培養基中，白花懸鉤子叢生芽的增殖系數最高，達到了7.84，極顯著高于其它處理。根據極差分析結果K值大小，我們初步確定最優組合為A383C2，即2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1NAA。從方差分析結果（表8）可見，6-BA（ P<0.01）和KT（P<0.04）均對增殖倍數有顯著影響，而NAA對結果無顯著影響（P>0.87），表明在白花懸鉤子叢生芽繼代增殖過程中6-BA為主要因素，KT為次要因素。綜合方差分析、極差分析和增殖系數，確定白花懸鉤子繼代增殖的最佳培養基為 MS+2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4mg.L-1 NAA。

2.4不同質量濃度IBA與NAA對生根與移栽的影響

由表9可知，在1/2MS培養基中單獨或者配合使用IBA與NAA均能使白花懸鉤子的組培苗生根。當單獨使用1.0 mg.L-1 IBA時，組培苗的平均株高、平均根長、平均根數與平均葉數均最高，分別達到了3.02 cm、6.16 cm、8.67條與2.47片，極顯著高于其它處理；當單獨使用1.0 mg·L-1NAA進行生根培養時，組培苗的平均根長、平均株高與平均葉數均處于較低水平，說明較高濃度的NAA會抑制組培苗的根與芽生長。當配合使用IBA與NAA時，組培苗的平均根長、平均株高與平均葉數等指標均顯著低于單獨使用1.0mg·L-1IBA（處理2）。因此，我們認為白花懸鉤子的最佳生根培養基是1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA。

將白花懸鉤子生根的組培苗經過馴化煉苗后移栽到泥炭土+珍珠巖（3：1，體積比）的混合基質中，20 d后植株生長良好，在生根培養基1/2MS+1.0 mg.L-1 IBA中培養獲得的生根無菌苗移栽成活率最高，達到了86.67%，極顯著高于其它處理。

綜合上述分析，我們建立了白花懸鉤子的葉片組培快繁體系，獲得了生長良好的生根苗（圖1）。

3討論與結論

外植體滅菌是組織培養中的一個重要環節，自然環境中采集的外植體往往攜帶大量的微生物，因此要求在滅菌過程中既能有效殺滅微生物，又不能損傷植物組織，以保證植物體活性。HgCI2、INaCIO、C2HSOH與KMnO4等溶液常被單獨或者組合用于外植體的滅菌，其組合方式與使用時間常會因材料而有所不同，需要經過試驗才能確定最佳的滅菌方法。在同屬植物樹莓組織培養中，于丹考察了單獨使用5% NaCl0與0.1% HgCl2的滅菌效果，認為用0.1％ HgCl2處理3min的效果最好：李艷霞等發現樹莓“波拉納”品種的莖段在75％酒精30 s+0.1％升汞8min+2%次氯酸鈉2 min中滅菌可獲得最低的污染率與最高的成活率。魏海霞等認為在對中國檉柳（Tamanx chinensis Lour.）進行外植體滅菌時采取75％酒精浸泡30 s、2％次氯酸鈉浸泡3-5 min和升汞浸泡5 min最適宜。在本研究中，我們考察了單獨使用與組合使用2％ NaClO與0.1％HgCl2溶液對白花懸鉤子葉片滅菌的影響，發現當兩者組合使用時可達到較好的滅菌效果，污染率均小于30%。由于滅菌劑的穿透力強，應嚴格掌握好處理時間，時間太長會破壞外植體的組織結構從而引起褐變，降低外植體的成活率。本研究采用2% NaCIO溶液滅菌2 min之后再使用0.1% HgCI2溶液滅菌5 min，能達到既有效殺死白花懸鉤子葉片上的微生物又最小限度傷害外植體的目的，污染率僅23.33%，存活率達73.33％且極顯著高于其它處理。

外植體的污染和褐化嚴重影響組培快繁技術成功水平，選擇適宜的外植體，不僅可以大大降低其污染率與褐化率，還可進一步提高其成活率。在已有的懸鉤子屬植物組培試驗中，通常選取的外植體材料是一年生帶芽嫩莖（單芽莖段）、莖尖或以未萌發的腋芽作為材料，目前尚未發現用該屬植物葉片進行組培快繁的研究報道。我們以白花懸鉤子葉片為外植體，建立了其組培快繁技術體系，研究結果既可為白花懸鉤子優質種苗的工廠化生產提供技術支持，又可為懸鉤子屬植物葉片組培快繁體系的建立提供參考依據。

對于懸鉤子屬植物，已有研究表明常見的MS、MT、White、N6、B5、NT等培養基均能滿足其生長需要，但國內外的研究者們更多地選擇MS培養基。Poothong等研究發現合理增加MS培養基中CaCl2、MgSO4和KH2PO4等無機鹽的含量能顯著促進懸鉤子屬植物的生長。本研究也選擇MS作為基本培養基，探討了不同植物激素種類及濃度對愈傷組織誘導、叢生芽分化和增殖以及生根培養的影響。

楊鼎元等對懸鉤子屬植物的組培快繁技術研究進展進行了綜述，發現植物生長調節劑的種類與劑量會因物種、外植體類型與組培過程的不同階段而各不相同。比如，紅樹莓（Rubus idaeus）的啟動培養與增殖培養均需要較高濃度的GA3（2-8 mg·L-1）以促進叢生芽的誘導與增殖，而掌葉覆盆子僅需要添加6-BA單一細胞分裂素即可達到較好的叢生芽誘導與增殖效果。徐亞英等以新生腋芽為外植體，著重探討了不同濃度的6-BA、NAA與IBA在樹莓離體快繁中的作用。在本研究中，我們發現當3.0mg.L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA組合使用時，白花懸鉤子的芽誘導率最高，達到了93.33％，極顯著高于其它處理：對于叢生芽的增殖培養，3.0 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+ 0.4mg·L-1 NAA組合使用也能在培養20 d后獲得最高的增殖系數（7.84），這一結果與劉潤和王鵬等分別在紅葉石楠與路易斯安娜鳶尾‘Noble Moment上的研究結果一致。因此，我們認為6-BA與KT配合能有效提高白花懸鉤子叢生芽的誘導率與增殖系數，效果優于單獨使用的。前人在懸鉤子屬植物的生根培養中均使用1/2MS培養基，使用最多的生長調節劑是NAA和IBA這兩種生長素，其劑量范圍較低，通常為0.05-1.0 mg/L NAA、0.05-1.0mg/L IBA。我們通過對白花懸鉤子組培苗的生根研究發現，白花懸鉤子的組培苗較容易生根，在營養成分減半的MS培養基中添加利于根系生長的IBA或者NAA均能促進其生根，這一結果也驗證了楊鼎元等的研究結論。

綜合本研究結果，白花懸鉤子最佳的葉片外植體滅菌方式為2qo NaClO溶液2min+0.1％HgCl2溶液5min，最佳的叢生芽分化誘導培養基為MS+3.0mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1NAA，最佳的繼代增殖培養基為MS+2.5 mg.L-16-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA，最適的生根培養基為1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA。白花懸鉤子組培快繁技術體系的建立既可為白花懸鉤子優質種苗的工廠化生產提供技術支持，又可為懸鉤子屬植物葉片組培快繁體系的建立提供參考依據。