利用CRISPR/Cas9技術編輯OsRR22基因創制耐鹽水稻種質資源

牛淑琳 鞠培娜 周冠華 戴南平 周晉軍 謝先芝 鄭崇珂

摘要：水稻是重要的糧食作物之一，在鹽堿地開發和改良中發揮著重要作用。為了創制高耐鹽水稻種質資源，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，在水稻品種鹽豐47中對OsRR22設計3個靶位點進行基因編輯。通過PCR和測序鑒定，在To代獲得16個突變單株，其中靶位點1和靶位點2均有純合突變，靶位點3沒有檢測到突變。在T1代轉基因株系中，獲得3株純合突變且無T-DNA插入的純合突變體。對T2代進行農藝性狀分析發現，與野生型相比，突變體的株高顯著降低，產量相關農藝性狀均無顯著變化。苗期耐鹽性鑒定結果表明，在200 mmol/L NaCI處理7天后，突變株的存活率比野生型提高30%以上。綜上，利用CRISPR/Cas9技術對水稻品種鹽豐47進行了耐鹽性改良，為耐鹽水稻新品種的培育提供了理論和材料基礎。

關鍵詞：水稻；耐鹽性；OsRR22；基因編輯

中圖分類號：S511：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0030-06

鹽漬化一度被稱為土地的“絕癥”，目前中國的鹽堿地面積約為1億公頃，其中可改良利用的鹽堿地約667萬公頃，這是一筆“沉睡”的寶貴資源。水稻是世界上重要的糧食作物之一，也是中國種植面積最大的糧食作物，對于保障糧食安全至關重要。水稻是一種對鹽濃度中度敏感的作物，由于其特殊的栽培方式，已成為鹽堿地改良利用的先鋒作物。為了更好地發揮水稻在鹽堿地改良中的作用，提高水稻耐鹽性，培育優質耐鹽水稻品種已經成為提高鹽堿地利用率和保障國家糧食安全的重要手段。

植物反應調控因子RR（response regulator）是一類重要的轉錄因子，參與細胞分裂素的信號轉導，調控植物的生長發育和脅迫耐性。水稻中包括13個A型RR基因（OsRRl-OsRR13）和6個B型RR基因（OsRR21-OsRR26）。Os-RR22/ORR2編碼一個含有696個氨基酸的B型反應調節蛋白，對于水稻的正常生長發育起著重要作用，該基因突變后水稻的耐鹽性明顯提高。WoIrhen等發現與野生型相比rr2//22/23突變體葉片更短，更窄：穗長變短，分支數變少：根長變短，側根形成量減少：而且在rr2//22/23突變體中，花藥心皮的柱頭刷發育受到損害從而妨礙花粉捕獲，這可能是導致籽粒填充不良的原因。Zhang等利用Cas9-OsRR22-gRNA表達載體敲除OsRR22，發現T2純合突變株的耐鹽性較野生型（wild type，WT）植株明顯增強。玉米中ABPH基因編碼A型應答調控因子ZmRR3，ABPHI通過負向調節細胞分裂素誘導的莖分生組織的擴張限制莖尖原基的起始空間，從而控制葉的分生模式。

CRISPR/Cas9系統是近年發展起來的一種準確、方便、高效的基因組編輯方法。基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術作為連接功能基因和遺傳改良的橋梁，越來越受到育種家的關注。Li等利用CRISPR/Cas9系統編輯Xa13啟動子，獲得了抗白葉枯病水稻。Zeng等利用CRISPR/Cas9系統同時編輯2個與產量相關的負調控基因（OsPIN5b和CS3）和1個耐冷基因（OsMyB30），獲得了高產耐冷水稻新品種。Alfatih等利用CRISPR/Cas9技術獲得的水稻PARAQUAT TOLERANCE3（Os PQT3）基因敲除突變體具有更高的產量及抗氧化和鹽脅迫能力。

本研究利用CRISPR/Cas9技術，以黃河三角洲鹽堿地主栽品種鹽豐47為遺傳轉化受體材料，對耐鹽基因Os RR22進行編輯，獲得有育種價值的純合突變體，為培育適宜在黃河三角洲鹽堿地種植的水稻品種提供耐鹽材料。

1材料與方法

1.1試驗材料與載體

以黃河三角洲鹽堿地主栽品種鹽豐47為遺傳轉化受體材料。所有材料種植于山東省農業科學院飲馬泉試驗基地，常規水肥管理。植物CRISPR/Cas9基因編輯載體（pYLCRISPR/Cas9Pubi-H）由華南農業大學劉耀光課題組饋贈。

1.2靶位點設計與載體構建

在水稻基因組注釋計劃數據網站RAP（ht-tps：//rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html）下載Os-RR22（Os06901831CO）基因組序列，利用CRISPR-GE（http：//skLscau.edu.cn/）設計OsRR22敲除靶點，選擇特異性好的候選靶位點作為目的靶位點，共選擇3個靶位點。載體構建參考單子葉敲除載體構建方法進行，針對3個靶位點，設計gRTl、gRT2、gRT3引物對，用于構建gRNA中間載體。Hpt和Cas9引物對分別用于轉基因植株篩選過程中對抗潮霉素基因Hpt和Cas9基因的篩選，OsRR22引物對用于對靶位點的重測序分析。引物（表1）合成與轉基因靶位點測序由北京擎科生物科技有限公司（青島）完成。構建好的轉化載體送至武漢伯遠生物科技有限公司進行遺傳轉化。

1.3To代轉基因株系獲得及突變位點檢測

利用CTAB法提取獲得的轉基因To代植株的基因組DNA，利用潮霉素基因Hpt進行轉基因植株的陽性檢測。利用OsRR22F2和OsRR22R2引物進行靶位點擴增，擴增片段送北京擎科生物科技有限公司（青島）進行測序。利用DNAMAN軟件進行測序結果分析。

1.4T1代無T-DNA株系篩選

將T0代自交獲得的T1代種子單株種植，分別提取DNA后用Hpt和Cas9基因檢測引物（表1）進行檢測，兩對引物都不能擴增出目的條帶，則認為該株系為無T-DNA插入株系，可用于下一步的分析。

1.5T2代純合突變體農藝性狀調查

T1代無T-DNA插入的單株自交后獲得T2代無T-DNA插入株系。每個株系種植3行，每行10株，行距×株距為25 cmx14 cm。在水稻抽穗期進行轉基因后代的抽穗期調查：待水稻完全成熟后，每個株系選擇15個單株進行株高、有效分蘗數、主穗長、主穗實粒數、千粒重等農藝性狀調查。

1.6OsRR22突變體耐鹽性鑒定

將純合的Os RR22突變體與野生型種植在96孔板上，以Yoshida營養液培養至三葉一心，參照張治振等的方法對突變體和對照進行鹽處理，具體為：水稻幼苗長到三葉一心后，用含有200mmol/L NaCl的Yoshida營養液處理7天，然后用不含NaCl的Yoshida營養液恢復培養7天，統計突變體和野生型存活單株數（有一片綠葉存活即記為存活單株），統計存活率。

存活率（%）=存活單株數／處理單株數×100。

2結果與分析

2.10sRR22基因編輯靶位點設計與載體構建

為提高突變效率，在OsRR22基因內部設計3個敲除靶位點，其中，在第一外顯子區設計兩個靶位點T1和T2，分別距離起始密碼子ATG 52 bp和117 bp，PAM序列均為CGG；T3靶位點位于第二外顯子區，距離ATG 522 bp，PAM序列為TGG（圖1A）。OsRR22-CRISPR敲除載體如圖1B。

2.2T0代轉基因株系的檢測及突變情況分析

將構建好的載體利用農桿菌介導法進行轉化，共獲得16株轉基因苗。用潮霉素（Hpt）引物進行檢測，所有植株均能檢測到特異條帶，說明均為轉基因陽性苗（圖2）。

利用特異性引物OsRR22F2和OsRR22R2對轉基因植株的靶位點區域進行擴增并測序分析。16個株系在靶位點Tl和12均發生突變，突變效率為100%，在T3靶位點未發生突變。其中，在靶位點T1檢測到純合突變株3株，占18.75%，雜合突變株5株，占31.25%，雙等位突變株8株，占50.00％；在靶位點T2檢測到純合突變株4株，占25.00％，雜合突變株3株，占18.75％雙等位突變株9株，占56.25%。

2.3T1代無T-DNA元件的突變植株篩選

將鹽豐47背景的To代靶位點T1為純合突變的單株自交后獲得T1代種子。隨機選取T1代種子100粒，萌發后種植在去除底部的96孔板中，以營養液培養至三葉一心期。按順序取樣后提取基因組DNA。用潮霉素鑒定引物進行篩選，獲得無潮霉素擴增的單株。然后對靶位點進行測序驗證，獲得純合突變且無T-DNA插入的單株，根據檢測到的單株排序，命名為rr22JI，rr22K1、rr22L/等（圖3）。自交留種后獲得T2代純合突變的轉基因株系，進行農藝性狀和耐鹽性分析。

2.4T2代純合突變體農藝性狀分析

對各個轉基因株系和野生型植株的調查結果表明，野生型植株和突變體植株抽穗期沒有明顯差異，突變體植株比野生型植株株高顯著降低，有效分蘗數、穗長、穗粒數、千粒重均無明顯差異（圖4）。說明Os RR22基因的敲除能夠顯著降低水稻株高，但對產量性狀影響不顯著。

2.5T2代純合突變體耐鹽性分析

為了鑒定突變體的耐鹽性，選擇3個T2代純合突變體（rr22J1、rr22K1和rr22L/）和野生型鹽豐47，同時種植在96孔板上進行耐鹽性試驗，結果（圖5）表明，野生型鹽豐47鹽處理后存活率只有28.81％，而突變體rr22J1、rr22K、rr22L1的存活率分別為70.71％、76.81％和58.89％，均顯著高于野生型鹽豐47，說明利用CRISPR/Cas9技術創制的基于OsRR22基因的突變體耐鹽性顯著提高。

3討論與結論

CRISPR技術是近年來發展迅速的基因定點編輯技術，是繼鋅指核酸酶（zine finger nuclease，ZFN）技術和轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases．TALENs）之后的第三代基因標記技術，具有成本低、效率高、構建簡單、操作便捷、特異性強等特點。利用該技術能夠快速完成基因敲除、插入、替換、點突變、轉錄調控和表觀修飾等操作，在細菌、植物和動物中均有應用，如Wu等利用CRISPR/Cas9技術成功將1，4-BDO（1，4-butanediol）合成途徑插入E．coti中，實現了1，4-BDO在微生物中的代謝生產；Gao等采用CRISPP/Cas9技術將NRAMP1（natural resistance-associated macrophage protein-1）基因敲入奶牛中，獲得了11頭抗結核轉基因牛；Tang等利用CRISPR/Cas9系統敲除金屬轉運體基因OsNramp5，培育出Cd積累量低且無轉基因的新稻株。在水稻中已有多個基因編輯提高水稻耐逆性、抗病性的報道。本研究結果也表明，該技術能夠有效地應用于水稻耐鹽種質創新中。

本研究利用CRISPR/Cas9技術對粳稻品種鹽豐47進行耐鹽基因OsRR22的定點編輯，以期獲得具有育種利用價值的純合突變材料。結果發現在獲得的16個To代轉基因株系中單個靶位點純合突變率最高為25％，以堿基插人為主（頻率為80％）：沒有發現兩個靶位點同時變異的純合株系：靶位點3沒有出現變異，可能是靶位點設計不合理或該靶位點在鹽豐47基因組中與參考基因組存在序列差異，導致打靶失敗。選擇靶位點1純合突變的株系自交繁殖后獲得T1代群體，靶位點測序顯示是與To代靶位點突變一致的株系，說明CRISPR技術編輯產生的突變能夠穩定遺傳給下一代。通過潮霉素標記篩選，將無T-DNA插入且靶位點純合突變的3個轉基因株系進行農藝性狀分析，結果發現除了株高有降低外，抽穗期和產量相關性狀均沒有明顯差異。通過苗期鹽處理后存活率統計發現，轉基因后代的耐鹽性顯著提高（增幅超過30個百分點）。因此對OsRR22基因進行定點編輯，能在不影響水稻產量的同時顯著提高水稻的耐鹽性：同時CRISPR/Cas9技術為水稻抗逆種質的創新提供了有利工具。