一例肉雞傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染的診斷與防治

馬芹 劉丹丹 鄒志強 馬元元 魏書強 李玉峰 汪建華

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：C 文章編號：1673-1085（2023）08-0088-05

雞傳染性支氣管炎（Infections bronchitis， IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infections bronchitis virus， IBV）感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病，最早發現于美國[1， 2]。H9亞型禽流感（Avian influenza， AI）是由H9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）引起的傳染病，該病為低致病性禽流感，廣泛分布于全國各地[3]。近幾年，隨著我國肉雞規模化養殖不斷發展，飼養條件得到了較大的改善，但是腎型傳染性支氣管炎的發病率沒有減少反而有增高的趨勢。該病典型的剖檢癥狀為支氣管栓塞、花斑腎，如果飼養管理不當易繼發大腸桿菌，使臨床雞群出現死淘較高的現象[4]。目前雞傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒和大腸桿菌的混合感染對臨床造成了巨大的經濟損失，本文從臨床診斷、病理剖檢及實驗室檢測等方面展開，建立科學有效的診斷和治療方法，對臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

山東聊城地區某養殖場18日齡商品肉雞。

1.2 主要試劑

營養瓊脂、膽硫乳、SS培養基購于青島海博生物技術有限公司；核酸提取試劑盒購于杭州博日科技股份有限公司；PCR反應式試劑購于南京諾維贊生物科技有限公司；微生物藥敏片購于杭州微生物試劑有限公司產品等。

1.3 方法

1.3.1 臨床觀察與剖檢 肉雞16日齡出現精神不振、有呼吸道癥狀，18日齡出現張嘴呼吸，全群死淘80～100只，23日齡死淘繼續上升，單日死淘400多只。將病死雞羽毛打濕，放置在解剖盤上，暴露其胸、腹腔，觀察氣囊、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌胃、腺胃等臟器有無明顯的病理變化，沿病死雞頭部一側剪開，觀察喉頭、氣管、支氣管有無病變。

1.3.2 細菌分離培養 在無菌工作臺內，取肝臟劃線接種于營養培養基、膽硫乳培養基、SS培養基上，37 ℃溫箱放置18～24 h，觀察培養基上菌落顏色和形態。

1.3.3 病毒檢測 取病死雞的氣管、喉頭、肺、肝脾、法氏囊等臟器剪碎后按1：3比例加入無菌PBS溶液，充分研磨制備組織懸液，反復凍融3次后，8 000 r/min 離心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具體提取步驟參考試劑盒內說明書。將提取的核酸進行疑似病原如H9亞型禽流感、傳染新支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、偏肺病毒（aMPV）、新城疫病毒（NDV）的PCR擴增，PCR擴增體系和程序參照南京諾唯贊擴增試劑說明書進行，擴增結束后在凝膠成像系統下進行觀察，陽性產物膠回收后連接轉化并進行測序分析。

1.3.4 病毒分離培養 將1.3.3制備的組織懸液經0.22 μm濾器過濾后，接種于9日齡SPF雞胚，每枚接種0.2 mL。放置于37 ℃溫箱培養，每天觀察有無死胚，24 h之內的死胚棄去，若出現死胚，收取24～144 h內死亡雞胚的尿囊液及胚體；若無死胚現象盲傳5代，進行PCR鑒定。

1.3.5 藥敏試驗 參考K-B紙片法[5]進行分離菌株的12種藥物（大觀霉素、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、多西環素、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、林可霉素、多粘菌素B、復方新諾明）的敏感性分析。將菌液均勻涂布于營養瓊脂培養板上，間隔適當位置進行藥敏片的粘貼與固定，在37 ℃恒溫培養箱倒置培養24 h，量取抑菌圈的直徑，判定藥物的敏感性。

2 結果

2.1 剖檢結果

病死雞通過剖檢觀察到肌胃、腺胃交接處有輕微出血，個別有纖維素性氣囊炎、心包炎和肝周炎，肝臟破裂出血，脾臟出血腫大，腎臟腫大呈典型的花斑狀，支氣管內有黃色干酪樣硬物，氣管內有出血點；見圖1。

2.2 細菌分離結果

經分離培養后，營養培養基上長出純凈單一的白色、邊緣光滑的菌落；膽硫乳和SS培養基上長出紅色或粉紅色小菌落，周圍有膽酸鹽沉淀圈，鏡檢觀察到革蘭氏陰性短桿菌，符合大腸桿菌的培養與鏡檢結果。

2.3 病毒檢測結果

通過PCR擴增，結果顯示IBDV、ILTV、aMPV、NDV未擴增出目的條帶，H9、IBV有單一條帶，且大小與目的片段一致，見圖2；經測序和Blast比對分析H9、IB陽性。將IBV進行S1基因測序，繪制進化樹（圖3），分析可知，該分離毒株屬于GI分支，且與QX株關系最近，為同一分支，與GII-GVII等分支的同源關系較遠。經Megalign比對分析可知，該分離毒株與QX株的同源性在90.4%～92%；與GII的同源性在59.3%，與GIII株同源性在61.4%，與GIV株同源性在57.2%，與GV同源性在64.7%，與GVI同源性在63.2%～63.6%，與GVII株同源性在67.3%，詳見圖4。

2.4 病毒分離培養結果

雞胚分離結果顯示，傳代培養后F3仍有90%的雞胚存活，收獲尿囊液盲傳至F4，死亡率為50%，收獲觀察到胚體發育矮小并蜷縮成球狀，羊膜增厚附著在胚體上，為典型的傳染性支氣管炎癥狀（圖5）。

2.5 藥敏試驗結果

目前實驗室藥敏結果顯示該大腸桿菌分離株對新霉素、多粘菌素B和多西環素敏感性較低，對大觀霉素、恩諾沙星、卡那霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、林可霉素、復方新諾明等9種藥物不敏感。大腸桿菌分離株藥敏試驗結果見表1。

3 討論與結論

肉雞傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染后，剖檢觀察肌胃腺胃交接處出血，支氣管內有黃色干酪樣硬物，腎臟腫大呈花斑樣，這與現場初期出現呼吸道癥狀、采食量下降以及隨后排水樣白色稀糞、糞便中含有大量尿酸鹽、死亡率升高相吻合[6]。傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬，經雞胚分離時能觀察到胚體發育萎縮呈小丸形，羊膜增厚，緊貼胚體，卵黃囊縮小，尿囊液增多，再經PCR和測序分析確定病原，本試驗為臨床傳染性支氣管炎感染病例提供了診斷技術和方法。臨床上發病后檢測是一方面，另一方面還應查清病因并進行預防。本試驗通過臨床分析、病理剖檢、細菌分離培養、病毒分離及分子生物學診斷等方法，確定了病原為傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒與大腸桿菌。大腸桿菌多隨病雞糞便排出體外，從而污染飼料、飲水、環境等，因此動物養殖環境的衛生條件和糞污的無害化處理等因素直接影響著的大腸桿菌的發生和流行[7-9]。本次發病臨床上緊急使用VC通腎，并使用傳染性支氣管炎活苗飲水，5日后使用強力霉素1個療程，使疾病得到了有效控制。為了防止該病再次發生，生產上應強化飼養管理，給雞群提供優質全價飼料，嚴格執行環境衛生消毒防疫措施，消滅傳染源，切斷傳播途徑。

參考文獻：

[1] ?韓雪芹，李斌.重新認識傳支做好對型防控[J].今日畜牧獸醫，2020，36（1）：23.

[2] ?寧岱.雞傳染性支氣管炎病毒的生物學特征及分型[J].當代畜牧，2018，29（10）：56-57.

[3] ?程祥琴.非典型新城疫與H9亞型禽流感混合感染的防治[J].中國家禽，2009，31（8）：51.

[4] ?徐翠娟.規模化肉雞飼養要重視腎型傳支的防治[J].山東畜牧獸醫，2018，39（5）：29-30.

[5] ?陶偉杰，段笑笑，趙輝，等. 血清7型副豬嗜血桿菌的分離鑒定及生物學特性研究[J].動物醫學進展，2021，42（12）：14-19.

[6] ?冀威.雞傳染性支氣管炎的診斷與治療[J].畜牧業環境，2020，8（1）：69.

[7] ?殷澤祿，萬虎. 大腸桿菌的研究綜述[J].甘肅畜牧獸醫，2019，49（5）：33-35.

[8] ?李永清，甘孟侯.禽大腸桿菌病防制研究進展[J].中國獸醫學報，2000，20（4）：414-416.

[9] ?廖曉萍，岳磊，曾振靈.禽源大腸桿菌耐藥現狀與防治對策[J].中國家禽，2008，30（6）：1-5.