楊樹(shù)腐爛病病原菌的分離及拮抗菌的篩選

張迪 馮爽 何可

摘 要：楊樹(shù)是我國(guó)北方常用的改善生態(tài)環(huán)境樹(shù)種，也是國(guó)內(nèi)木材生產(chǎn)主要樹(shù)種之一。楊樹(shù)腐爛病是一直危害楊樹(shù)的主要病癥。本文從楊樹(shù)腐爛病入手，分離其病原菌并結(jié)合當(dāng)下對(duì)于植物內(nèi)生細(xì)菌的研究，進(jìn)一步探索植物內(nèi)生拮抗菌為生物防治提供的有效新思路。

作者簡(jiǎn)介：

張迪（1988.03），男，吉林雙遼，漢族，大學(xué)本科，營(yíng)林工程師，營(yíng)林生產(chǎn)方向，安圖森林經(jīng)營(yíng)局島安林場(chǎng)工作。

通訊作者：馮爽（1989.04），女，吉林雙遼，漢族，大學(xué)本科，營(yíng)林工程師，營(yíng)林生產(chǎn)方向，安圖森林經(jīng)營(yíng)局天保管護(hù)大隊(duì)工作。

何可（1989.06），女，吉林省通榆縣，滿族，大學(xué)本科，營(yíng)林工程師，天然林保護(hù)部，副部長(zhǎng)，營(yíng)林方向，主要從事天然林保護(hù)相關(guān)工作，安圖森林經(jīng)營(yíng)局工作。

1 實(shí)驗(yàn)材料試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）病原菌分離的植物材料：采自安圖森林經(jīng)營(yíng)局島安林場(chǎng)內(nèi)，楊樹(shù)腐爛病發(fā)病時(shí)期的枝干發(fā)病部位。

（2）內(nèi)生細(xì)菌的分離材料：采自安圖森林經(jīng)營(yíng)局島安林場(chǎng)內(nèi)健康楊樹(shù)的根、莖、葉。

1.2 供試培養(yǎng)基及配方

（1）病原菌分離：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PDA）。馬鈴薯200.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂粉15.0g、水1000mL；

（2）內(nèi)生細(xì)菌分離：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂粉15.0g、PH值7.3±0.1。

2 研究方法

2.1 楊樹(shù)腐爛病病原菌的分離

采用組織分離法。于紫外線殺菌30min后的無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行操作，在超凈工作臺(tái)上將采集的樹(shù)皮病斑樣本清洗干凈，用無(wú)菌剪刀剪成大小為0.5mm×0.5mm的小塊，然后進(jìn)行表面消毒。在無(wú)菌玻璃器皿中先用70%酒精浸泡30s，用無(wú)菌鑷子將病組織塊移入0.1%升汞溶液中浸泡3min，然后將升汞溶液傾倒出去，用無(wú)菌水洗30s，沖洗4次，盡可能沖去酒精和升汞的殘留物。

表面消毒結(jié)束后，用無(wú)菌鑷子夾取病組織塊擺放于注有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察，待長(zhǎng)出菌落后，選擇不同菌落，挑取菌落邊緣的菌絲分別轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得分離菌株。

2.2 楊樹(shù)腐爛病病原菌的純化

采用稀釋純化法。將分離出來(lái)的不同菌株培養(yǎng)至菌落基本長(zhǎng)滿平板后，直接在平板內(nèi)加入少量的無(wú)菌水，用無(wú)菌接種鏟將菌落融入無(wú)菌水中，配制成菌懸液，再用無(wú)菌水將菌懸液稀釋。用顯微鏡觀察，稀釋到每個(gè)視野中盡量只有一個(gè)分生孢子時(shí)，把稀釋的菌懸液滴入新的PDA培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌涂布器均勻涂抹，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。依此方法純化3次后，挑取菌餅置于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌苔后，將斜面試管移入冰箱4℃冷藏層保存。

2.3 分離菌的致病性測(cè)定

真菌接種孢子懸液的配制：將純化的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d左右，用1mL的無(wú)菌水將平板上的孢子沖洗下來(lái)，混入20mLPDA液體培養(yǎng)基內(nèi)，振蕩培養(yǎng)（28℃，180r/min36h），用無(wú)菌水稀釋至濃度為1.0×108個(gè)/mL左右的孢子懸浮液。

采用離體枝條接種法。取健康新鮮的楊樹(shù)枝條，先用水把枝條表面沖洗干凈，再用70%酒精和0.1%的升汞分別進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次，晾干。將枝條剪成15cm長(zhǎng)的小段，兩端都用石蠟封好，用無(wú)菌接種針在枝條上劃出傷口，將制成的孢子懸液涂抹在這些傷口上，以無(wú)菌水涂抹做對(duì)照。接種后置于無(wú)菌托盤(pán)內(nèi)，覆蓋無(wú)菌濕紗布保濕，再以保鮮膜封好，28℃保濕培養(yǎng)，分別在6d、8d、10d觀察發(fā)病情況并記錄病斑大小。

2.4 楊樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

取健康楊樹(shù)的根、莖、葉，用70%的酒精表面清洗后，剪成0.5～1cm的枝段，浸泡在70%的乙醇中1min，再用3.25%的次氯酸鈉浸泡15min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗4次，放置在PDA平板上培養(yǎng)。從上述培養(yǎng)基平板里挑出沒(méi)長(zhǎng)出微生物菌落的（說(shuō)明表面消毒徹底）部分放入已滅菌的研缽中，加入45mL無(wú)菌水，碾碎，攪拌，靜止，將上清液涂抹于NA培養(yǎng)基表面，倒置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。24h后將長(zhǎng)出的特征不同的菌落進(jìn)行劃線純化，此操作進(jìn)行3次后，獲得純化菌株轉(zhuǎn)至NA斜面培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出菌落后置于4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 室內(nèi)拮抗菌篩選

在PDA平板上培養(yǎng)7d的楊樹(shù)腐爛病菌菌落上，用打孔器打出直徑5mm的菌碟，放置于新的PDA平板中間，在距培養(yǎng)皿邊緣10mm處點(diǎn)接內(nèi)生細(xì)菌菌株（2個(gè)點(diǎn)對(duì)稱），設(shè)只接病原菌的為對(duì)照，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第5天測(cè)楊樹(shù)腐爛病菌菌落寬度，并計(jì)算抑菌率。

3 結(jié)果與分析

3.1 楊樹(shù)腐爛病病原菌分離及致病性檢測(cè)

對(duì)采集回實(shí)驗(yàn)室的病樹(shù)皮進(jìn)行組織分離后，共純化出4株真菌，分別編號(hào)為F1-4。致病性測(cè)定結(jié)果顯示，在接種6d時(shí)，觀察，均未有病斑產(chǎn)生；接種8d時(shí)觀察，F(xiàn)1、F2、F4、菌株與對(duì)照一樣未表現(xiàn)異常，而F3菌株接種處開(kāi)始有明顯的病斑產(chǎn)生，病斑與楊樹(shù)腐爛病初期癥狀一致，也產(chǎn)生酒糟味；接種10d時(shí)，F(xiàn)1、F2、F4、菌株與對(duì)照仍未有異常表現(xiàn)，F(xiàn)3菌株侵染產(chǎn)生的病斑有明顯的擴(kuò)大。說(shuō)明分離出的4株菌中只有F3菌株對(duì)楊樹(shù)枝條具有侵染活性，并且產(chǎn)生了與楊樹(shù)腐爛病一致的癥狀。

按照柯氏法則，將接種發(fā)病的楊樹(shù)枝條再分離，獲得的菌株性狀與第一次分離到的F3菌株一致，從而確定再次分離的菌株即為楊樹(shù)腐爛病的病原菌，是下一步實(shí)驗(yàn)的病原菌。

3.2 楊樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的分離

通過(guò)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的分離，在健康楊樹(shù)的根、莖、葉中均分離出一定菌群密度的內(nèi)生細(xì)菌，根部菌群密度為1.85×104Cfu·gfw?1，莖的菌群密度為1.22×104Cfu·gfw?1和葉的菌群密度為1.13×104Cfu·gfw?1，可見(jiàn)根部的菌群密度要高于莖和葉部的菌群密度，存在較大差異，總體呈現(xiàn)根部＞莖部＞葉部的趨勢(shì)。

從分離出的細(xì)菌中找出菌落有差異的菌株進(jìn)行純化，共純化出26株菌株，其中，根部15株（編號(hào)為G1～15）、莖部7株（編號(hào)為J1～7）、葉部4株（編號(hào)為Y1～4）（表1）。

3.3 楊樹(shù)腐爛病菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

利用平板拮抗法，篩選楊樹(shù)腐爛病菌F3的拮抗細(xì)菌，從抑菌率來(lái)看（見(jiàn)表2），26株菌中，只有G2、G5、G8、G11、G14、J4、J7、Y1這幾個(gè)菌株有一定的抑菌作用，從楊樹(shù)不同器官來(lái)看，在根、莖、葉分離出的內(nèi)生細(xì)菌中篩選出具有拮抗作用的菌株數(shù)量分別為5、2、1，根中所含的拮抗菌數(shù)量占總菌數(shù)的百分比最高，為19.2%。其中抑菌率＞50%的有3株菌，分別是G2、G8、G14，均分離自根部，而莖和葉中分離出的細(xì)菌具有拮抗活性的菌株數(shù)量一方面較少，另一方面表現(xiàn)的拮抗活性也較低。

4 結(jié)論

從觀察到楊樹(shù)腐爛病癥狀的楊樹(shù)病斑上分離到4株真菌，按照柯氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定后，確定F3菌株為病原菌，并從再次發(fā)病的病斑上分離到該菌。

從健康楊樹(shù)的根、莖、葉中分離到大量的內(nèi)生細(xì)菌，純化出26株菌落差異較大的菌株，根部15株、莖部7株、葉部4株。

通過(guò)平板拮抗，在26株內(nèi)生細(xì)菌中有8株菌對(duì)楊樹(shù)腐爛病菌有抑菌作用，表現(xiàn)出一定的抑菌率，抑菌率＞50%的菌株菌分離自楊樹(shù)根部。