CSIA在有機污染物生物降解中的應用進展及文獻計量學分析

郭 瑤，王 瑩，梁繼東

（1. 國家能源集團 神東煤炭集團有限責任公司，陜西 榆林 719300；2. 西安交通大學 環境科學與工程系，陜西 西安 710049）

有機污染物廣泛存在于環境中，生物修復技術在有機污染場地的修復方面展現出巨大的應用潛力［1］。評估有機污染物的生物降解程度、解析有機污染物的生物降解機理，在受污染土地管理、風險評估和生物修復措施確定等方面具有重要意義，而科學、準確、高效地定量化分析污染物的降解效率是其前提保障。目前常采用氣相色譜（GC）或氣相色譜-質譜（GC-MS）法對有機污染物進行定量分析，但需預先用特定溶劑進行萃取。該方法存在以下問題：1）有機污染物中可萃取和不可萃取的成分是不確定的，特別是對于污染復雜且時間較長的環境樣品；2）環境樣本中一部分先前不可萃取的化合物經生物降解后轉化為可萃取成分；3）有機污染物的降解受到賦存環境等諸多因素的影響，會發生物理、化學和生物轉化，其中生物轉化又涉及同化、異化及部分中間代謝產物再分解等過程，受環境因素干擾較大［2-3］。20世紀90年代發展起來的單體穩定同位素分析（compound-specific stable isotope analysis，CSIA）技術，可克服上述問題，已逐漸被應用于環境分析領域，成為目前研究有機污染物環境行為的新技術［4-5］。CSIA能夠為有機污染物的來源及生物降解提供精確信息，因而受到越來越廣泛的關注［6］。例如，對碳氫化合物生物降解過程中碳和氫穩定同位素進行聯合分析，可量化同位素組成并推斷特定物質在環境中的來源和命運。該方法不僅能區分有機污染物的來源，還能識別和量化轉化反應。

文獻計量學是指將數學和統計學的方法運用于文獻及其他交流介質研究的一門學科。它能夠在海量的文獻數據中通過定量和模型分析客觀展示出學科的研究現狀并推測其未來發展趨勢。雖然目前關于CSIA技術分析生物降解機理的研究很多，但缺乏從文獻計量角度對整體研究現狀的系統回顧。因此，通過網絡關系圖對重要信息進行聚類分析并量化已發表的文獻數據，對于了解CSIA技術應用于有機污染物生物降解領域的最新動態和發展趨勢具有重要意義。

基于此，本文詳細介紹了穩定同位素分析方法和CSIA技術的原理，并從Web of Science（WOS）數據庫收集數據，利用引文分析軟件CiteSpace對CSIA用于有機污染物生物降解領域的研究進行了文獻計量學分析，以期為CSIA技術在實際場地的應用提供參考。

1 穩定同位素及其分析方法

原子由質子、中子和電子組成。具有相同質子數、不同中子數（或不同質量數）的同一元素的不同核素互為同位素。同位素可分為兩大類，即放射性同位素（如14C）和穩定同位素（如12C和13C）。穩定同位素是指某元素中不發生或極不易發生放射性衰變的同位素。穩定同位素之間雖然幾乎沒有化學性質的差別，但其物理性質常有微小差異［7］。同位素組成常用同位素豐度表示，指在一種元素的同位素混合物中，某種特定同位素的原子數與該元素總原子數之比。在天然物質中，大多數元素的同位素組成具有恒定性［8］。例如，碳元素的兩種穩定同位素12C和13C的自然豐度分別為98.89%和1.11%［9］。但是，自然條件下的多種作用不斷對同位素進行分離，故隨著樣品來源環境的變遷，其同位素組成也在某一范圍內變化。

有機化合物主要由碳（C）和氫（H）元素組成，也可能含有氧（O）、氮（N）、硫（S）、氯（Cl）等元素，這些元素均至少有兩種穩定同位素。一般存在于自然界的某種元素，其同位素中輕同位素的相對豐度很高，而重同位素的相對豐度很低，例如氫元素。水是氫元素的主要來源，海水中氫（1H）的豐度為99.984 4%，而氘（2H）的豐度僅為0.015 6%［8］，這使得其同位素比值R（某一元素的重同位素豐度與輕同位素豐度之比）很小，不利于分析比較［9］。此外，通過不同實驗室的儀器及同一臺儀器的多次分析測得的同位素比值可能存在偏差。為了便于比較分析，國際上統一采用δ值（‰）表示某元素的同位素組成，指樣品中某元素的同位素比值相對于國際參考標準物質同位素比值的千分差（見式（1））［10］。目前，碳同位素的國際參考標準物質是V-PDB（vienna pee dee belemnite），氫同位素的國際參考標準物質是V-SMOW（vienna standard mean ocean water）［11］。

式中，Rs和Rr分別為樣品和國際參考標準物質中某元素的同位素比值。

δ值可通過GC-C-IRMS進行測定，該儀器由GC、中間連接裝置（C，connection）和同位素比值質譜儀（IRMS，isotope ratio mass spectrometer）3個部分組成。中間連接裝置可以是高溫燃燒（氧化）爐或高溫裂解（還原）爐。樣品經GC分離后，進入高溫燃燒爐（例如碳元素氧化）或高溫裂解爐（例如氫元素還原），碳元素可被高溫氧化為氣態CO2，氫元素可被高溫裂解還原為氣態H2，然后待測氣體（CO2或H2）通過接口進入IRMS分析［6］，便可獲取樣品中目標化合物特定元素的δ值。

2 CSIA技術定量分析有機污染物的原理

1994～1995年，MERRITT等［12-13］首次介紹了CSIA技術，運用GC-C-IRMS在線分析了混合有機物中各特定化合物（質量濃度為μg/mL級）的同位素組成，并探討了該方法的穩定性、靈敏性、數據獲取與校正、界面性能優化等問題。輕重同位素不同的零點能會引起量子力學效應的微小差異。一般而言，與重同位素相比，輕同位素因零點能更高而形成的化學鍵更弱［7］。輕重同位素形成的分子間化學鍵鍵能差異導致的同位素在不同化合物或不同物相間分布不均勻的現象稱為同位素分餾［14-18］。CSIA技術可測定特定化合物中某元素的同位素比值（組成），進而可根據同位素分餾效應分析有機污染物的降解規律。

近年來的研究證明了某些污染物的生物轉化會導致穩定同位素的分餾，基于此可構建生化反應過程中同位素組成與污染物濃度隨時間變化的定量關系，進而可推測復雜環境中污染物的生物降解過程［19-22］。穩定同位素具有特征性和穩定性，可用于環境污染物生物降解的精確定量評估。在生物降解有機污染物過程中，可分析穩定同位素的動力學分餾，即由于分子反應位點上輕重同位素反應活性不同，動力學反應速率不同，導致的底物與產物中同位素分布不對等的效應［23-24］。而在生化反應中，同位素的動力學分餾會隨酶催化反應的動力學而改變［25］。一般情況下，穩定同位素的動力學分餾可分為兩類：一級動力學分餾，由同位素直接參與的化學鍵轉換過程；二級動力學分餾，同位素參與的化學鍵不發生斷裂但可能發生減弱或重新雜化的過程，且其在反應中是速率決定步驟。后者的反應速率常數通常比前者小一個數量級。由于氫同位素的質量差異較大，二級動力學分餾效應變化顯著［26-27］。同位素分餾與反應動力學的關系可以用穩定同位素分餾因子α（重同位素的反應速率常數與輕同位素的反應速率常數之比）來表示［11］。

在生物降解過程中，同位素比值和殘余底物濃度之間的關系可以用Rayleigh方程來描述（見式（2））［28-32］。一般而言，自然環境中輕同位素的豐度遠高于重同位素，所以有R+1≈1，對式（2）進行了簡化，得到式（3）。

式中：Rt和R0分別為在t和0時刻的底物同位素比值；ct和c0分別為在t和0時刻的底物濃度。

底物單位增量引起的同位素分餾變化量通常用同位素富集因子（ε，‰）來表征，ε與α的關系見式（4）。

結合式（1）和式（4），將式（3）用對數形式表示，得到式（5）。按式（5）進行線性擬合，ε為該線性回歸方程的斜率［33］。

式中，δt和δ0和分別為t和0時刻測定元素的δ值。

利用同位素比值的變化評估有機污染物的生物降解率（B，%），見式（6）［34］。

3 文獻計量學分析

為探明CSIA在有機污染物生物降解研究中的應用（2000年開始陸續出現相關報道）趨勢，本工作以收錄于WOS核心合集的文獻（2000～2022年）為數據源，以“biodegradation”或“transformation”為關鍵詞搜索與CSIA相關的論文，通過精確篩選獲取179篇有效論文，再借助CiteSpace軟件對精選文獻進行計量學分析［35］，結果如下。

通過相關領域各發文國家的共現網絡分析（見圖1）發現，CSIA用于有機污染物生物降解與轉化研究的論文主要集中于德國、美國、加拿大、瑞士、法國等歐美發達國家。最早通過該技術進行有機物生物降解研究的國家包括荷蘭、美國和澳大利亞，這些國家從2000年開始有相關的研究論文發表，且發文數量隨時間呈現遞增趨勢。我國起步較晚，從2010年后逐漸有相關論文發表。由此可見，歐美發達國家憑借環境學科整體先發優勢及自有大型儀器設備，在學科前沿探索方面要領先于我國。21世紀10年代以來，隨著我國經濟的快速發展，研究資金和大型儀器進口力度加大，支持我國學者近十年來在相關領域研究的投入，呈現發文量大幅增長趨勢。

圖1 基于WOS檢索CSIA用于有機污染物生物降解與轉化研究的國內外發文量共現網絡圖（2000～2022年）

從國內外發文的研究機構共現網絡圖（見圖2）可以發現，德國亥姆霍茲聯合中心、加拿大多倫多大學和瑞士納沙泰爾大學的論文發表數量和合作單位數量均居國際前列，這與這些國家的發文量優勢是一致的，說明這些國家相關領域的研究相對集中于上述研究機構。美國雖然整體發文量位居國際前列，但沒有突出的研究機構，說明相關領域研究分散于美國的不同研究機構中。我國的研究機構發文數量排名靠后，且與國際機構合作發文量少，這是因為我國在相關領域的研究起步較晚，尚未有研究機構形成優勢，未來需要加強與國際領先機構的合作與交流。

圖2 基于WOS檢索CSIA用于有機污染物生物降解與轉化研究的國內外機構共現網絡圖（2000～2022年）

從相關研究領域關鍵詞共現網絡圖（見圖3）可以發現，同位素分餾現象是CSIA用于有機污染物生物降解與轉化規律探索的基礎，研究污染環境對象主要涉及地下水和特定場地，研究的關鍵污染物包括氯乙烯、環己烷、叔丁基醚、胺類殺蟲劑和芳香烴等，污染物降解途徑主要涉及好氧和厭氧生物降解、自然衰減、還原脫氯等過程。

圖3 基于WOS檢索CSIA用于有機污染物生物降解與轉化研究的關鍵詞共現網絡圖（2000～2022年）

需要說明的是，本工作采用同樣的方法檢索中國知網（CNKI），但得到的研究型論文數量有限，不足以開展文獻計量學研究，說明該領域仍屬國際前沿研究。另外，國內相關研究機構除在國際期刊發聲外，也應輻射中文期刊，為相關領域知識在國內更廣泛的傳播提供支持。

4 CSIA技術應用進展

CSIA技術已被應用于有機污染物生物降解程度的評估中［36-38］。有學者研究了好氧生物降解對原油正構烷烴氫同位素組成的影響，發現氫同位素分餾程度與烴鏈長度有關，并通過Rayleigh方程得到了C15～C18的α為0.981 1～0.996 2［39］。TANG等［40］將CSIA運用到3種模式的復合回流人工濕地（IRCWs）對毒死蜱的原位生物降解研究中，分析了添加植物和生物炭對毒死蜱生物降解的影響，并在不同的處理組中得到了不同的碳同位素富集因子ε（0.69‰±0.06‰，0.91‰±0.07‰，1.03‰±0.09‰）。XU等［41］通過CSIA得到了6種擬除蟲菊酯在微生物降解過程中的碳同位素富集因子ε，其中溴氰菊酯（-2.00‰）、甲氰菊酯（-1.88‰）和順式氯氰菊酯（-1.82‰）產生顯著的碳同位素分餾效應，并據此建立了一種土壤中生物利用度的新估算方法。QIAN等［3］應用CSIA對污染土壤中六氯環己烷（HCH）同分異構體進行了生物降解研究，測定了不同污染場地土壤樣品中HCH的濃度和碳同位素比值，得到了土壤中α，β，γ，δ-HCH生物降解的碳同位素富集因子ε，分別為2.0‰，1.5‰，3.2‰，1.4‰，這對于現場土壤中HCH同分異構體的原位生物降解定性和定量評價具有重要意義。

CSIA技術在有機污染物生物降解轉化過程中另一大應用是判斷有機污染物的降解途徑。傳統研究有機物降解機理的方法主要是依靠各種質譜手段（如GC-MS和LC-MS等），通過對中間產物的分析推測可能的降解途徑。這種方法具有一定的缺陷，因為同一產物可能有不同的來源，僅僅通過中間產物不能準確推斷降解機理［42-46］。有機污染物在生物轉化過程中，不同轉化途徑中化學鍵的斷裂和生成方式不同，這會產生不同的動力學同位素效應（kinetic isotope effect，KIE，與α互為倒數），因此可以通過KIE或ε得到降解機理的相關信息［6，47］。一般用CSIA技術測得的同位素組成包含了分子中某元素的所有原子，分子反應位點（原子）的同位素分餾變化量高于由測得的同位素比值計算得到的整體同位素分餾變化量，即存在“同位素稀釋效應”，此時利用KIE或ε研究有機污染物的降解機理會使研究的準確性受到質疑［48］。為此，有研究者引入了具體反應位點的表觀動力學同位素效應（apparent kinetic isotope effect，AKIE）這一概念，對同位素稀釋效應進行校正，可更為合理地探討環境中有機污染物的反應機理［9］。KüMMEL等［28］通過氫同位素分餾的差異區分了萘和2-甲基萘的好氧和厭氧過程，并通過氫同位素的AKIE值探討了不同降解過程中的生物降解途徑。CHEN等［49］在含有阿特拉津氯水解酶基因（AtzA）的菌株中觀察到正常碳和逆氮的同位素分餾程度較低。有機物被微生物代謝過程中，大部分情況下底物中含輕同位素的分子會被微生物首先利用，而在殘余底物中含重同位素的分子得以富集，造成穩定同位素分餾，即正常的同位素分餾；但少數情況下存在相反的現象，即逆同位素分餾。氮元素得到逆同位素分餾，表明底物中重氮元素被利用，說明AtzA通過配位Cl和芳香族N從碳氯鍵中提取電子，從而促進親核攻擊，催化阿特拉津水解脫氯。ELSNER等［34］總結了不同親核取代反應（C—C1，C—N，C—O鍵斷裂）中C—H鍵和C=C鍵氧化反應的同位素分餾數據和不同類型反應的碳、氫穩定同位素的AKIE范圍。

當參與反應的兩個或多個原子包含多種元素時，可進行二維或多維CSIA，該方法能有效消除環境因素變化對同位素分餾的影響和對同位素的掩蔽，從而更好地進行降解機理解析［46］。BERGMANN等［50］報道了在苯的厭氧降解過程中測得的碳氫同位素富集因子：εC=-2.5‰±0.2‰，εH=-55‰±4‰（硫酸鹽還原菌）；εC=-3.0‰±0.5‰，εH=-56‰±8‰（鐵還原菌），從而計算得到雙同位素富集因子（Λ）（Λ=20±2，17±1），與之前報道的硝酸鹽還原菌相似。一般認為，對于苯厭氧降解，可用ε對兼性厭氧菌（反硝化）和嚴格厭氧菌（硫酸鹽還原、發酵）進行區別，該研究結果打破了此前的觀點。而CUI等［11］則利用好氧生物降解中碳和氫的同位素分餾得到喹啉和3-甲基喹啉的Λ值（分別為20±2和8±2），證明了底物特異性可能對喹啉類化合物生物降解的同位素分餾產生重要影響。

5 結語和展望

CSIA技術具有特征性和穩定性，可為環境污染物生物降解的精確定量評估提供有效手段，同時CSIA相較于傳統的穩定同位素方法，也可以判斷有機污染物的降解途徑及降解機理，在有機污染物環境行為研究方面具有廣泛且重要的應用前景。然而，有機污染物降解過程中并不是都會產生可觀測的同位素比值變化，當特定污染物的特定元素同位素比值變化不明顯時，采用單一元素的穩定同位素對環境污染物的降解行為進行分析會帶來很大的不確定性。為了便于比較分析，二維CSIA甚至多維CSIA技術的應用極大可能成為該領域未來發展的趨勢。另外CSIA技術作為一種新興技術尚處于初級應用階段，加之自然環境是一個復雜的系統，要想將CSIA技術應用到實際場地中，依然需要對各種環境過程中有機物同位素分餾效應進行進一步的研究解析，以獲取精確的特征參數。