不同濃度二甲雙胍對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和miR-409-3p表達(dá)的影響

馬靜　杜鑫　張慧敏　郝翠芳

［摘要］目的觀察不同濃度二甲雙胍對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和miR-409-3p表達(dá)的影響。方法選取2020年6—12月在青島市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（IVF/ICSI）助孕的多囊卵巢綜合征（PCOS）病人（PCOS組）和無PCOS不孕病人（對照組）各20例，收集其卵巢顆粒細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）方法檢測卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p的相對表達(dá)量。體外培養(yǎng)人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN，采用CCK8法檢測不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L）二甲雙胍作用KGN細(xì)胞24、48和72 h的細(xì)胞活力，并計(jì)算半抑制濃度（IC₅₀）值；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用EDU染色試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性；采用Q-PCR方法檢測KGN細(xì)胞中miR-409-3p表達(dá)水平的變化。結(jié)果PCOS組的黃體生成素（LH）、LH/卵泡刺激素（FSH）、抗繆勒管激素（AMH）、睪酮（T）和獲卵數(shù)均顯著高于對照組（t=3.49～9.79，P＜0.05）。與對照組相比，PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p相對表達(dá)量顯著降低（t=2.91，P＜0.05）。二甲雙胍對KGN細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，且具有濃度依賴性；二甲雙胍可以促進(jìn)KGN細(xì)胞miR-409-3p的表達(dá)（F=556.63，P＜0.01）。結(jié)論5.0、10.0、20.0 mmol/L的二甲雙胍對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。二甲雙胍可能通過上調(diào)miR-409-3p的表達(dá)調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，對PCOS排卵異常的恢復(fù)可能有積極作用。

［關(guān)鍵詞］多囊卵巢綜合征；二甲雙胍；卵巢；顆粒細(xì)胞；微RNAs；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

［中圖分類號(hào)］R711.75［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2023）03-0383-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.090［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230801.1100.002.html;2023-08-0114：52：15

EFFECTS OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF METFORMIN ON PROLIFERATION， APOPTOSIS AND MIR-409-3P EXPRESSION OF HUMAN GRANULOSA CELLS MA Jing， DU Xin， ZHANG Huimin， HAO Cuifang （Centre for Reproductive Medicine of Qingdao Woman and Childrens Hospital， Qingdao University， Qingdao 266011， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effects of different concentrations of metformin on proliferation， apoptosis， and miR-409-3p expression of human granulosa cells. MethodsThe granulosa cells were collected from 20 polycystic ovarian syndrome（PCOS） patients （PCOS group） and 20 infertile patients without PCOS （control group） assisted by in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection （IVF/ICSI） in the Center for Reproductive Medicine of Qingdao Women and Childrens Hospital from Jun to Dec. 2020. The expression of miR-409-3p in granulosa cells was detected by Quantitative real time polymerase chain reaction （Q-PCR）. Human ovarian granulosa cell line KGN was cultured in vitro. CCK8 was used to detect the cell viability of KGN cells treated with different concentrations of metformin （2.5， 5.0， 10.0， 20.0， 40.0 mmol/L） for 24， 48 and 72 h respectively， and calculated the semi-inhibitory concentration （IC₅₀）. The apoptosis rate was detected by flow cytometry， cell proliferation activity was observed by EDU staining kit and Q-PCR was used to detect the miR-409-3p expression of KGN cells. ResultsThe luteinizing hormone （LH）， LH/ follicle-stimulating hormone （FSH）， Anti-Mullerian hormone （AMH）， testosterone （T） and the number of oocyte obtained in PCOS roup were significantly higher than those in control group （t=3.49-9.79，P＜0.05）. Compared with the control group， the expression of miR-409-3p in granulosa cells of PCOS group was significantly decreased （t=2.91，P＜0.05）. Metformin could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of KGN cells in a dose-dependent manner. Metformin could promote the expression of miR-409-3p in KGN （F=556.63，P＜0.01）. ConclusionMetformin of 5.0， 10.0 and 20.0 mmol/L can regulate the proliferation and apoptosis of human granulosa cells. Metformin may regulate the proliferation and apoptosis of granulosa cells by up-regulating the expression of miR-409-3p. It suggests that metformin has a positive effect on the recovery of abnormal ovulation in PCOS.

［KEY WORDS］polycystic ovary syndrome; metformin; ovary; granulosa cells; microRNAs; cell proliferation; apoptosis

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌疾病[1]。PCOS病人通常有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，包括月經(jīng)不調(diào)、卵泡發(fā)育不良、高雄激素血癥、胰島素抵抗和不孕等[2]。盡管有越來越多的證據(jù)表明PCOS的發(fā)生與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，但目前對PCOS的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[3]。卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的雌激素是卵泡發(fā)育成熟的重要條件，顆粒細(xì)胞的凋亡在卵泡閉鎖中起主導(dǎo)作用。有研究表明，PCOS病人的顆粒細(xì)胞凋亡率明顯低于正常排卵周期的婦女，其機(jī)制可能與凋亡效應(yīng)物表達(dá)減少和細(xì)胞生長因子表達(dá)增加有關(guān)[4]。因此，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡或抑制顆粒細(xì)胞的生長可能是治療PCOS的一種潛在方法。二甲雙胍是治療2型糖尿病的有效藥物，是一線降糖藥，在胰島素抵抗的PCOS病人中普遍應(yīng)用。microRNA（miRNA）是由21～25個(gè)核苷酸殘基組成的小型非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等活動(dòng)[5-6]。張坤等[7]綜合多項(xiàng)研究結(jié)果表明，miRNA可通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖、胰島素抵抗、高雄激素血癥等促進(jìn)PCOS的發(fā)生發(fā)展。盡管二甲雙胍在PCOS伴胰島素抵抗的病人中常規(guī)使用，但是該藥對PCOS卵巢顆粒細(xì)胞功能的影響目前仍不清楚。本研究旨在觀察不同濃度二甲雙胍對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡及miRNA表達(dá)水平的影響，探討二甲雙胍對卵巢顆粒細(xì)胞的可能調(diào)控機(jī)制。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2020年6—12月在青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（IVF/ICSI）助孕的PCOS病人（PCOS組）和無PCOS不孕病人（對照組）各20例。記錄兩組病人的基本臨床資料并收集其卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。PCOS組病人均基于Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)（2004年）嚴(yán)格篩選[8]；對照組病人均因輸卵管或者男方因素而尋求IVF/ICSI治療；兩組病人的年齡均≤35歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性腎上腺增生、庫欣綜合征和雄激素分泌性腫瘤等高雄激素血癥疾病；甲狀腺功能亢進(jìn)、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌性疾病；夫婦雙方染色體異常等。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要材料

人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；二甲雙胍（北京索萊寶）；miRNA分離試劑盒（山東思科捷）；miRcute Plus miRNA第一鏈cDNA試劑盒（北京天根生化）； SPARKscript Ⅱ RT-Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（山東思科捷）；AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix（南京諾唯贊公司）；QuantStudioTM 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）儀（Applied Biosystems，美國）；Q-PCR引物（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成）；CCK8 solution（北京索萊寶）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海翌圣）；EDU細(xì)胞增殖測試試劑盒（廣州銳博生物）。

1.3研究方法

1.3.1臨床資料的收集收集兩組病人的基本臨床資料，其內(nèi)容包括：年齡、不孕時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、抗苗勒管激素（AMH）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、LH/FSH、雌二醇（E2）、睪酮（T）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、抑制素（INHB）、空腹血糖（FBG）以及獲卵數(shù)和胚胎形成率。

1.3.2卵巢顆粒細(xì)胞的收集和培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞的收集采用拮抗劑方案，當(dāng)目標(biāo)卵泡直徑至少有1個(gè)≥18 mm、有2個(gè)≥17 mm時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素（HCG）扳機(jī)，在注射HCG后36 h，進(jìn)行超聲引導(dǎo)下穿刺取卵以獲得卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，用注射器針頭仔細(xì)分離每個(gè)卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞。將獲得的卵巢顆粒細(xì)胞用PBS清洗3次后，保存于－80 ℃，直至RNA提取。收集的顆粒細(xì)胞和KGN細(xì)胞采用含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.3Q-PCR檢測卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)按照miRNA分離試劑盒說明書提取收集的顆粒細(xì)胞以及KGN細(xì)胞中的miRNA，應(yīng)用NanoDrop One紫外分光光度計(jì)測定其濃度以及純度，按照miRcute Plus miRNA第一鏈cDNA試劑盒說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后再按照AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用QuantStudioTM 5 Q-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以U6作為miRNA的內(nèi)參。引物序列見表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2^{－△△ＣＴ}法計(jì)算miR-409-3p的相對表達(dá)量。

1.3.4CCK8法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞鋪設(shè)96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞密度為5×107/L。貼壁培養(yǎng)6 h后加入各濃度（2.5、5.0、

3期馬靜，等. 不同濃度二甲雙胍對人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和miR-409-3p表達(dá)的影響385

10.0、20.0、40.0 mmol/L）的二甲雙胍進(jìn)行處理，分別于處理24、48和72 h后每孔加入10 μL CCK8溶液繼續(xù)反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔光密度（OD）。細(xì)胞活力（%）=（加藥細(xì)胞OD－空白OD）/（對照細(xì)胞OD－空白OD）×100%；抑制率（%）=（對照細(xì)胞OD－加藥細(xì)胞OD）/（對照細(xì)胞OD－空白OD）×100%。

1.3.5細(xì)胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞鋪設(shè)6孔板，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，每孔5×105個(gè)細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)6 h后加入各濃度（根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)中的抑制率選擇濃度為5.0、10.0、20.0 mmol/L）的二甲雙胍進(jìn)行處理，48 h后收集細(xì)胞。用500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL的 Annexin V-FITC染色液以及10 μL 的PI染色液后混勻，4 ℃避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6EDU實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞，按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種至24孔板。貼壁培養(yǎng)6 h后加入各濃度（5.0、10.0、20.0 mmol/L）的二甲雙胍進(jìn)行處理，48 h后使用含有1∶1 000 EDU溶液的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液孵育細(xì)胞2 h，用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用Apollo染料染色。根據(jù)試劑盒說明書，使用Hoechst33342反應(yīng)液進(jìn)行細(xì)胞核染色。在熒光顯微鏡下隨機(jī)獲取5個(gè)視野的熒光圖像并計(jì)算EDU陽性細(xì)胞率，EDU陽性細(xì)胞率（%）=（EDU和Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)）/Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8軟件（GraphPad Software，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組病人臨床資料比較

PCOS組病人的LH、LH/FSH、AMH、T均顯著高于對照組（t=3.62～9.79，P＜0.05），促排卵之后的獲卵數(shù)也顯著高于對照組（t=3.49，P＜0.05）；兩組之間年齡、不孕時(shí)間、BMI、FSH、PRL、P、E2、FBG、INHB和胚胎形成率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2兩組病人卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p表達(dá)水平的比較

Q-PCR檢測結(jié)果顯示，PCOS組和對照組病人卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)水平分別為0.70±0.44、1.82±1.68。與對照組相比，PCOS組病人miR-409-3p的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.91，P＜0.05）。

2.3二甲雙胍對KGN細(xì)胞增殖的影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L）的二甲雙胍處理不同時(shí)間（24、48、72 h），細(xì)胞生長出現(xiàn)不同程度的抑制（F=96.63～630.60，P＜0.01）。見圖1。根據(jù)二甲雙胍對KGN細(xì)胞增殖的抑制率，計(jì)算出二甲雙胍作用24、48和72 h對KGN細(xì)胞的半抑制濃度（IC₅₀）分別為30.93、15.37和6.92 mmol/L。

2.4二甲雙胍對KGN細(xì)胞凋亡的影響

使用5.0、10.0、20.0 mmol/L濃度的二甲雙胍處理KGN細(xì)胞48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，隨著二甲雙胍濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加（圖2）。

2.5二甲雙胍對KGN細(xì)胞增殖抑制活性

EDU實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示，使用5.0、10.0、20.0 mmol/L濃度的二甲雙胍處理KGN細(xì)胞48 h后，EDU陽性細(xì)胞率分別為（18.67±2.08）%、（16.00±1.00）%和（12.33±1.16）%。與對照組（不加二甲雙胍）的（23.67±1.16）%相比較，5.0、10.0、20.0 mmol/L二甲雙胍處理組細(xì)胞的增殖活性呈濃度依賴性降低（F=34.11，P＜0.001）。見圖3。

2.6二甲雙胍對KGN細(xì)胞miR-409-3p表達(dá)影響

根據(jù)IC₅₀值，選擇10.0和20.0 mmol/L濃度的二甲雙胍作用KGN細(xì)胞48 h。對照組（不加二甲雙胍處理組）和10.0、20.0 mmol/L二甲雙胍處理組細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)水平分別為1.00±0.07、4.02±0.13和6.41±0.31。與對照組比較，給予二甲雙胍處理組KGN細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)顯著上調(diào)（F=556.60，P＜0.001）。

3討論

PCOS是育齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂綜合征，因稀發(fā)排卵或無排卵而導(dǎo)致不孕，PCOS所致不孕約占無排卵不孕的75%[9]。卵泡的發(fā)育成熟是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，卵巢顆粒細(xì)胞合成的激素與生長因子通過縫隙連接影響卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的生長分化、成熟，進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育[10]。目前的研究表明，PCOS婦女早期生長卵泡中的顆粒細(xì)胞增殖增加和凋亡減少，這可能導(dǎo)致卵泡的發(fā)育異常和排卵障礙[4，11-12]。因此，抑制顆粒細(xì)胞的生長或促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡有可能恢復(fù)PCOS病人卵泡發(fā)育和排卵的異常。

二甲雙胍廣泛用于治療PCOS胰島素抵抗的病人，是胰島素的增敏劑[13]。大量證據(jù)表明，二甲雙胍可以有效地調(diào)節(jié)代謝紊亂與性激素水平，例如減輕體質(zhì)量，降低胰島素、血脂和雄激素水平，恢復(fù)正常月經(jīng)周期和排卵[14]。但是，目前關(guān)于二甲雙胍對PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞的影響研究還很少。因此，本研究用不同濃度的二甲雙胍處理KGN細(xì)胞，采用CCK8實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，EDU實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，二甲雙胍對KGN細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，對細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，且上述作用均具有濃度依賴性。宋霽[15]研究結(jié)果表明，二甲雙胍影響PCOS病人顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，這與本研究結(jié)果相一致。

近年來miRNA在卵巢顆粒細(xì)胞生長和卵母細(xì)胞發(fā)育中作用的研究報(bào)道越來越多，即使是單一的miRNA的變化也會(huì)對細(xì)胞表型或卵母細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生不利影響[16]。本研究分離了PCOS病人的卵巢顆粒細(xì)胞并測定其miR-409-3p表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)水平顯著降低。目前有相關(guān)研究報(bào)道，PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)下降，而miR-130b-3p、miR-9、miR-186和miR-135a的表達(dá)水平升高[17-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-99a、miR-424和miR-206可抑制人卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[21-23]。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-16和miR-155可促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡[24-25]。有生物信息學(xué)研究結(jié)果表明，二甲雙胍可改變miRNA的表達(dá)，如可以降低PCOS病人血清中miR-122、miR-223和miR-29a的表達(dá)[26-27]。但是目前尚未有人研究二甲雙胍是否可影響PCOS病人顆粒細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10.0和20.0 mmol/L濃度的二甲雙胍作用于KGN細(xì)胞48 h，細(xì)胞中miR-409-3p的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明隨著miR-409-3p的表達(dá)上調(diào)，KGN細(xì)胞增殖率降低、凋亡率增加。提示二甲雙胍可能通過上調(diào)miR-409-3p表達(dá)，抑制PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，二甲雙胍能夠明顯促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖，并且抑制增殖作用呈濃度依賴性，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-409-3p的表達(dá)有關(guān)。本文研究結(jié)果為臨床二甲雙胍的使用提供了新的認(rèn)識(shí)。

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（本文編輯馬偉平）