幽門螺桿菌對常用抗生素的耐藥性及23S rRNA基因突變位點分析

趙云冬?宋順佳?姜菲菲?王丹?趙瀟穎?楊志平

摘要：目的 檢測幽門螺桿菌（Hp）對5種常見抗菌藥物的耐藥性，指導臨床合理用藥。方法 收集2019年9月至2021年6月在北華大學附屬醫院消化內科就診患者的胃黏膜標本165例，經13C呼氣試驗確診Hp陽性，分離培養Hp。采用瓊脂稀釋法檢測Hp對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐藥性。提取Hp基因組DNA，PCR擴增23S rRNA基因，將PCR產物測序分析突變特征。結果 Hp藥敏結果顯示，165株Hp菌株對甲硝唑的耐藥率最高，占90.91%（150/165），左氧氟沙星的耐藥率占83.03%（137/165），克拉霉素耐藥率占70.30%（116/165），阿莫西林耐藥率占18.18%（30/165），利福平耐藥率占16.36%（27/165）。對所有抗生素均敏感的Hp菌株占9.09%（15/165），多重耐藥菌株占90.91%（150/165），其中雙重耐藥占28.49%（47/165），三重耐藥占35.15%（58/165），四重耐藥占20%（33/165），五重耐藥占7.27%（12/165）。23S rRNA基因測序結果表明最常見的突變位點為A2143G，突變率為82.76%（96/116），A2142G突變率為6.03%（7/116），A2223G突變率為4.31%（5/116），但是另有8株耐藥菌株未發生基因突變，占6.90%（8/116），敏感菌株均未發生基因突變。結論 Hp對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率高，對阿莫西林和利福平的耐藥率較低，23S rRNA基因突變是導致克拉霉素耐藥的主要原因。

關鍵詞：幽門螺桿菌；抗生素；耐藥性；23S rRNA

中圖分類號：R978.1， R446.5文獻標志碼：A

Resistance of Helicobacter pylori to common antibiotics and analysis?of 23S rRNA gene mutation

Zhao Yun-dong1， Song Shun-jia1， Jiang Fei-fei1， Wang Dan1， Zhao Xiao-ying， and Yang Zhi-ping2

（1 Medical Technology College of Beihua University， Jilin 132013; 2 Affiliated Hospital of Beihua University， Jilin 132011）

Abstract Objective To detect the drug resistance of Helicobacter pylori （Hp） to five common antibiotics and to guide the rational use of drugs in clinic. Methods Gastric mucosal specimens of 165 patients treated in the Department of Gastroenterology， Affiliated Hospital of Beihua University from September 2019 to June 2021 were collected. Hp positive was confirmed by 13C breath test， and Hp was isolated and cultured. The drug resistance of Hp to metronidazole， clarithromycin， levofloxacin， amoxicillin， and rifampicin was detected by the Agar dilution method. Hp genomic DNA was extracted， 23S rRNA gene was amplified by PCR， and the PCR products were sequenced to analyze the mutation characteristics. Results The drug sensitivity of Hp strains showed that the resistance rates to metronidazole， levofloxacin， clarithromycin， amoxicillin， and rifampicin were 90.91% （150/165）， 83.03% （137/165）， 70.30% （116/165）， 18.18% （30/165）， and 16.36% （27/165）， respectively. Sensitivity to all antibiotics accounted for 9.09% （15/165）．Multi-drug resistant strains accounted for 90.91% （150/165）， among which double drug resistance accounted for 28.49% （47/165）， triple drug resistance accounted for 35.15% （58/165）， quadruple drug resistance accounted for 20% （33/165）， and five drug resistance accounted for 7.27% （12/165）. The results of 23S rRNA gene sequencing showed that the most common mutation site was A2143G， and the mutation rate was 82.76% （96/116）. The mutation rate of A2142G was 6.03% （7/116）， and the mutation rate of A2223G was 4.31% （5/116）. However， there were no gene mutations in eight drug-resistant strains， accounting for 6.90% of the total， and no gene mutations were found in all sensitive strains. Conclusion Hp has high resistance to clarithromycin， metronidazole， and levofloxacin， but low resistance to amoxicillin and rifampicin. 23S rRNA gene mutation is the main cause of clarithromycin resistance.

Key words Helicobacter pylori; Antibiotics; Drug resistance; 23S rRNA

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是革蘭陰性桿菌，在人類胃中定植，Hp感染可導致胃或十二指腸潰瘍、慢性胃炎，甚至胃癌或胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，根除Hp可大大降低上述疾病的發病風險[1]。世界衛生組織（WHO）已將其列為Ⅰ類致癌因子[2]。據統計，全球約有50%的人口感染Hp，我國Hp的平均感染率高達55%[3]。除非接受治療，否則Hp的定植往往會持續終生。近年來隨著抗生素的大量使用，Hp的耐藥率逐年升高，并且出現了較高比例的多重耐藥菌株，導致Hp根除率越來越低?？死顾兀╟larithromycin，CLA）、甲硝唑（metronidazole，MTZ）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、阿莫西林（amoxicillin，AMO）、利福平（rifampicin，RFP）等是臨床常用的抗菌藥物。有項研究表明Hp對甲硝唑的耐藥率最高，為66.8%、其次是克拉霉素和左氧氟沙星，分別為39.9%和34.5%，阿莫西林和四環素的耐藥率較低，分別為6.7%和4.9%[4]。因此應根據抗生素耐藥性選擇合適的治療方案，才能取得較好的療效。本研究對Hp陽性患者的胃黏膜標本進行分離培養及鑒定，采用瓊脂稀釋法檢測Hp對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐藥性，并對耐藥基因23S rRNA進行測序，探討Hp耐藥與基因突變之間的關系，為治療Hp合理選擇抗菌藥物提供理論依據，指導臨床個體化用藥，有望提高其根除率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者臨床資料

收集2019年9月至2021年6月期間在北華大學附屬醫院消化內科就診的患者胃黏膜標本。納入標準：年齡18～80歲，性別不限；治療前經13C-UBT（碳13尿素呼氣試驗）證實為Hp陽性者；經病理診斷或胃鏡確診為消化性潰瘍或慢性胃炎；曾經未接受過正規治療去根除Hp；簽署知情同意書。排除標準：近1個月服用鉍劑、抗生素、抑酸劑及非甾體類抗炎藥者；對該研究所用藥物過敏者；患心、腦、肝、肺、腎疾病及嚴重的全身疾病者；有幽門梗阻、急性消化道出血、胃癌及胃部切除手術史者；有精神方面疾病，未能配合檢查者；孕期及哺乳期者[5]。符合納入標準的165例Hp感染的慢性胃炎或消化性潰瘍患者作為研究對象，未曾接受過根除Hp的正規治療。

1.1.2 藥品與試劑

13C-UBT檢測試劑盒購自北京勃然制藥有限公司；無菌脫纖維綿羊血購自青島海博生物有限公司、Columbia Agar Base購自英國Oxoid公司；抗生素購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司）；厭氧培養系統（廣州市尤德生物科技有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；TC9600-G多功能梯度PCR儀（美國Labnet公司）；JY-600C型雙穩定時電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hp培養

取胃黏膜標本經充分研磨后接種于含10%無菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞血瓊脂培養基上，于37℃微需氧環境（5% O2、10% CO2、85% N2）中培養72 h，肉眼觀察菌落形態，挑選典型菌落進行革蘭染色鏡檢，鏡下為革蘭陰性桿菌再分別經尿素酶試驗、氧化酶試驗、觸酶試驗確證Hp，三者均為陽性，證實為Hp，傳代培養。

1.2.2 藥敏試驗

采用瓊脂稀釋法檢測Hp對克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的最低抑菌濃度（MIC），首先無菌條件下配置含不同抗菌藥物濃度的瓊脂平板，取Hp菌落研磨于0.9% NaCl溶液中，配制成6×108 CFU/mL的菌懸液，吸取2～3 μL滴加到抗生素平板上，于37℃、微需氧環境培養72 h后觀察藥敏試驗結果。根據CLSI標準及相關文獻判定耐藥：克拉霉素最低抑菌濃度≥1.0 μg/mL，甲硝唑≥8.0 μg/mL，左氧氟沙星≥1.0 μg/mL，阿莫西林≥0.5 μg/mL，利福平≥4.0 μg/mL定為Hp對該藥物耐藥[6-7]。單一耐藥指只對1種抗生素耐藥，雙重耐藥指同時對2種抗生素耐藥，三重耐藥指同時對3種抗生素耐藥，四重耐藥指對4種抗生素同時耐藥，五重耐藥指對5種抗生素同時耐藥。

1.2.3 PCR擴增及測序分析

從GenBank數據庫中調取23S rRNA基因序列，應用DNAMAN軟件設計特異性引物。引物序列：F-CCACAGCGATGTGGTCTCAG、R-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC，擴增片段長度為425 bp。25 μL反應體系：上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環，72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像系統拍照觀察。將PCR產物送往生工測序。應用 DNAMAN 8.0和MEGA-X 5.1分子生物學軟件分析23S rRNA基因核苷酸序列突變形式。

2 結果

2.1 鑒定Hp

將Hp菌株培養3～5 d 后，哥倫比亞血平板上長滿灰白色、針尖樣、小菌落，革蘭染色后鏡下可見典型的呈S形、螺旋狀的革蘭陰性桿菌，尿素酶試驗、氧化酶試驗、觸酶試驗結果均陽性，證明為Hp菌株（圖1）。

2.2 Hp對5種抗生素耐藥情況

165株Hp菌株克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和利福平表現不同程度的耐藥性，對克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的耐藥率較高，對阿莫西林和利福平的耐藥率較低，阿莫西林仍可作為根除Hp的一線抗菌藥物（表1）。

2.3 Hp多重耐藥情況

165株Hp菌株對所有抗生素均敏感的僅有15株（占9.09%），多重耐藥菌株150株（占90.91%），其中雙重耐藥47株（占28.49%），三重耐藥58株（占35.15%），四重耐藥33株（占20%），五重耐藥12株（占7.27%），見表2。

2.4 測序結果分析

116株克拉霉素耐藥菌株中，108株23S rRNA基因發生突變，突變率為93.10%，最常見的突變位點為A2143G，突變率為82.76%（96/116），A2142G突變率為6.03%（7/116），A2223G突變率為4.31%（5/116），但是另有8株耐藥菌株未發生基因突變，占6.90%（8/116），敏感菌株中均未發現基因突變。

3 討論

Hp是一種螺旋狀、有鞭毛的革蘭陰性致病菌，定植于黏液層，也附著在分泌黏液的胃上皮細胞表面。感染Hp可導致一些胃腸道疾病，例如慢性胃炎、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、消化性潰瘍以及腸化生。根除Hp可降低消化性潰瘍的復發，緩解早期胃MALT淋巴瘤，同時預防胃癌的發生發展[8]。Hp感染的根除治療一直是胃腸病領域的研究熱點之一，近年來，隨著臨床上抗生素的廣泛使用，Hp的耐藥率日漸增長，Hp對抗菌藥物產生耐藥性是導致其根除治療失敗的主要原因，因此了解Hp對抗生素的耐藥現狀對于指導臨床個體化用藥，選擇最佳治療方案，提高Hp根除療效具有重要意義。

標準三聯療法的根除率低于80%，因此不推薦作為Hp的一線根除療法[9]。目前由“質子泵抑制劑+兩種抗生素+鉍劑”組成的四聯療法作為根除Hp的一線治療方案，克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、左氧氟沙星及四環素是臨床常用的備選抗菌藥物[10-11]。隨著抗菌藥物的不合理使用，Hp對抗生素的耐藥性逐年上升，并且出現越來越多的多重耐藥菌株，導致Hp的根除率越來越低。王松研究顯示武漢地區Hp對甲硝唑的耐藥率占43.45%，克拉霉素耐藥率占21.74%，阿莫西林耐藥率較低占13.04%[12]。周雄杰研究顯示Hp對甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星耐藥率較高，分別為87.8%、49.7%和48.5%，對阿莫西林和四環素耐藥率較低，分別占8.7%和11.6%[13]。本研究結果顯示甲硝唑的耐藥率為90.91%（150/165），左氧氟沙星的耐藥率為83.03%（137/165），克拉霉素耐藥率為70.3%（116/165），阿莫西林耐藥率為18.18%（30/165），利福平耐藥率為16.36%（27/165）。并且出現了不同程度的多重耐藥性，其中雙重耐藥47株（占28.49%），三重耐藥58株（占35.15%），四重耐藥33株（占20%），五重耐藥12株（占7.27%）。最常見的耐藥模式是克拉霉素、甲硝唑和喹諾酮類藥物的三重耐藥。Hp的耐藥性因藥物和地理區域的不同而不同[14]。文婷婷等[15]研究結果顯示昆山地區Hp多重耐藥菌株占56.86%。趙平等[16]研究顯示西安地區多重耐藥菌株占34.71%，其中雙重耐藥占24.79%。不斷增加的抗生素多重耐藥性是成功控制Hp感染的重大挑戰，在中國發現了三重、四重和五重甚至六重耐藥菌株，這突顯了快速測定藥物敏感性對提高Hp根除成功率的必要性，若在治療前進行藥敏試驗可指導臨床合理選擇抗生素，提高Hp根除成功率。

23S rRNA基因V區發生突變是導致Hp對克拉霉素產生耐藥性的主要機制，其中A2143G、A2142G和A2142C是最常見的突變位點[17]。本研究結果顯示A2143G突變率最高，占82.76%（96/116），A2142G突變率占6.03%（7/116），A2223G突變率占4.31%（5/116），但是另有8株耐藥菌株未發生基因突變，提示可能存在其他因素導致了克拉霉素的耐藥，安瑩研究結果表明敲除外排泵基因hefA、hefD和hefG能增加Hp對克拉霉素的敏感性，并且逆轉一些耐藥菌株對克拉霉素的耐藥性[18]。

本研究檢測了Hp對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林及利福平的耐藥性，其中克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率較高，利福平和阿莫西林的耐藥率相比較低。通過相關耐藥基因測序結果發現23S rRNA基因與克拉霉素的耐藥性相關。檢測Hp對抗生素的耐藥情況，對于制定合適的抗菌藥物組合方案，指導臨床合理用藥具有重要意義。

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