脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與甲潑尼龍聯(lián)合用藥對小型豬異體皮膚移植的影響

焦廣明,呂英光,桑金芳,寇志鵬,劉 濤,王 月,陸翔宇,樸晨曦,馬亞軍,張建濤,王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.黑龍江省動物疾病致病機制與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,哈爾濱 150030)

同種異體皮膚移植是指同種之間的不同個體間進行皮膚移植手術(shù),一般廣泛應(yīng)用于自體皮膚發(fā)生大面積缺損,如燒傷或者創(chuàng)傷等,無法滿足自體移植的情況[1]。但在移植之后,會產(chǎn)生非常嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)[2]。這種并發(fā)癥可以在短時間內(nèi)大量表達(dá)IL-2、IFN-γ等炎性因子破壞移植皮片,促使移植皮片壞死[3]。為抑制免疫排斥反應(yīng),目前臨床上常用的方式是使用免疫抑制劑。有研究表明,單獨使用雷帕霉素抑制劑或糖皮質(zhì)激素等藥物均具有良好的抑制免疫排斥的效果[4],但也可能會造成延長炎癥期,抑制血管遷移,肉芽組織再生等傷口愈合不良的副作用[5]。因此為降低藥物副作用,免疫抑制劑聯(lián)合用藥的方法被廣泛應(yīng)用于抗排斥反應(yīng)的治療中。MP是聯(lián)合用藥中較為常用的藥物[6],因其具有良好的抗排異效果在組織器官移植上廣泛應(yīng)用,所以本試驗采用MP作為聯(lián)合用藥的藥物之一。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是近年來細(xì)胞療法的主要應(yīng)用細(xì)胞之一,其主要分布于脂肪、骨髓、胎盤、牙髓等組織部位[7]。其中ADSCs以取材方便,無倫理性,免疫原性低,治療效果好等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于各種疾病的研究中[8],并已經(jīng)取得了很好的效果。因其具有抑制免疫排斥反應(yīng)[9]、炎癥反應(yīng)、組織纖維化[10]、氧化應(yīng)激,并促進細(xì)胞再生等優(yōu)勢,在皮膚損傷相關(guān)的研究中得到了很大關(guān)注[11-12]。因此本試驗采取ADSCs與MP聯(lián)合用藥。

有研究表明,巴馬小型豬皮膚厚度、分層、光鏡結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、以及一些特殊結(jié)構(gòu)都與人相似[13]。并且在豬、人、兔等皮膚損傷時應(yīng)用IL-1α后,小型豬與人的皮膚創(chuàng)口的愈合速度顯著提高,這說明豬與人的皮膚損傷主要是通過創(chuàng)面上皮化來修復(fù)。而兔是通過創(chuàng)口收縮的方式愈合[14]。所以小型豬作為動物模型可以更準(zhǔn)確地 模擬出ADSCs+MP對人異體皮膚移植的影響。

本試驗通過比較ASG、MP、ADSCs、ADSCs+MP對小型豬異體皮膚移植所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)與創(chuàng)口愈合方面的影響。旨在研究ADSCs+MP在抗排異與促進創(chuàng)口愈合方面的應(yīng)用前景,并為ADSCs+MP對異體皮膚移植臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本試驗經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會監(jiān)督,選取1歲齡廣西巴馬小型豬12頭(30～40 kg,雌雄各半)。經(jīng)臨床與實驗室健康檢查后進行試驗。在整個試驗過程中,飼養(yǎng)管理條件保持一致。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

獸用便攜式多參數(shù)監(jiān)護儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),動物呼吸麻醉機(美國SurgiVet公司),EPOCH連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國BIOTEK基因有限公司),組織研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

丙泊酚乳狀注射液(西安力邦制藥有限公司),異氟烷(河北一品制藥有限公司生產(chǎn)),DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Invitrogen有限公司),胎牛血清(美國Clark公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaKa生物技術(shù)有 限公司),熒光定量PCR染料(湖南Innovagene科技有限公司),IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-2、IL-1β、IFN-γ、皮質(zhì)醇、CXCR4、SDF-1(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),SOD、GSH(南京建成生物工程研究所)。免疫印跡中使用的一抗:PI3K(abclonal,A16950,1∶1 000)、AKT(abclonal,WH133854,1∶1 000)、P-AKT(Wanleibio,WLP001a,1∶1 000)、11β-HSD1(abclonal,WH298017,1∶1 000)、11β-HSD2(Proteintech,14192-1-aP,1∶1 000)、NF-κB(Wanleibio,WL01980,1∶500)、P-NF-κB(Wanleibio,WL02169,1∶1 000)、VEGF(abclonal,WH306346,1∶1 000)、TGF-β(abclonal,A2124,1∶1 000);二抗:山羊兔抗(Proteintech,SA00001-2,1∶10 000)。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組 將12頭小型豬隨機分為4組:異體皮膚移植(ASG)組,甲潑尼龍(MP)組,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)組,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與甲潑尼龍聯(lián)合用藥(ADSCs+MP)組。

1.3.2 動物試驗 試驗采用同種異體皮膚移植手術(shù),每次需要兩頭小型豬同時開展手術(shù)。將兩頭小型豬同時麻醉后,分別在背部造8個4 cm×4 cm的創(chuàng)口,創(chuàng)口間距5 cm。并且將取下來的皮膚修整,保留表皮與真皮層,將兩頭豬的皮片順次交換移植到異體皮膚上,采取結(jié)節(jié)縫合(圖1),待異體皮膚移植結(jié)束后,用紗布固定,每日護理換紗布,并在7 d時拆除縫合線。其中ASG組:術(shù)后不用藥干預(yù),MP組:在術(shù)后頸部肌肉注射甲潑尼龍,注射劑量為5 mg·kg-1,連續(xù)注射7 d。ADSCs組:術(shù)后即刻在每個皮片下面進行皮下注射ADSCs。每個皮片的注射劑量為5×104·cm-2。ADSCs+MP組:術(shù)后即可在每個移植皮片皮下注射5×104·cm-2ADSCs,在頸部肌肉注射甲潑尼龍5 mg·kg-1連續(xù)7 d。所有組的豬均在術(shù)前與術(shù)后7、14 d采集血液和組織樣本,術(shù)后即刻、7、14、21 d拍照記錄移植表皮臨床變化情況。

圖1 手術(shù)模式圖與術(shù)后即刻圖片

1.3.3 小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采用手術(shù)的方式取出小型豬兩側(cè)腹股溝皮下脂肪,去除筋膜與血管,并放入0.1%I型膠原酶中37 ℃消化55 min,消化結(jié)束后,1 500 r·min-1離心10 min,去除上清液,加入完全培養(yǎng)基。重懸后200目濾網(wǎng)過濾,再次1 500 r·min-1離心10 min,去掉上清液。加入5 mL紅細(xì)胞裂解液1 500 r·min-1離心5 min,去掉上清液。加入完全培養(yǎng)基、接培養(yǎng)瓶并放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合70%～80%時傳代,傳到3～5代時收集脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,備用。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 血常規(guī)及血清生化檢測 本研究采用五分類血常規(guī)WBC、NEU、LYM按照血常規(guī)儀器說明書步驟進行操作。GLB按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.2 炎癥相關(guān)因子和愈合相關(guān)因子檢測 炎癥相關(guān)因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ與愈合相關(guān)因子皮質(zhì)醇、CXCR4、SDF-1均按照ELISA試劑盒(酶聯(lián),上海)說明書的步驟操作。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo) GSH與SOD,均按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 蛋白提取與免疫印跡 取全層皮膚組織研磨碎,放入RIPA(invent in-wb001)、PMSF(碧云天st506-2)等冰上孵育30 min,離心取上清,BCA(碧云天)測蛋白濃度,調(diào)平蛋白濃度加上樣緩沖液,煮沸10 min,-80 ℃保存。取出蛋白上清,加到已經(jīng)配好的膠中開始電泳。電泳結(jié)束后開始切膠,轉(zhuǎn)模,封閉,敷抗體、洗膜、敷二抗、洗膜、曝光。

1.4.5 總RNA的提取與實時熒光定量PCR 總RNA采用TRzoL試劑(Invitrogen,15596-026) 分離,使用染料(Vazume,Q711-02),研究使用引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.6 組織學(xué)分析和免疫組化染色 將取樣皮膚放入4%多聚甲醛固定,待固定后石蠟包埋,用蘇木精伊紅染色。在免疫組化方面,用石蠟切片染色,檸檬酸鈉修復(fù)液、亞沸騰修復(fù),2%的山羊血清室溫封閉1 h,10%山羊血清稀釋一抗CD4+(Proteintech,67786-1-Ig,1∶1 000)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 異體皮膚移植皮片表觀檢查

圖2顯示,ASG組的移植皮片7 d時可見大量表皮脫落并形成白色苔蘚樣病變,移植皮片紅腫,皮片觸感較硬。14 d時移植皮片顏色變黑,皮片觸感堅硬,切開皮片時可見真皮與表皮全層全部變黑。MP組的移植皮片在7 d時,質(zhì)地較軟,顏色潮紅。14 d時MP組出現(xiàn)皮片顏色大面積變黑,質(zhì)地較硬,切開皮片發(fā)現(xiàn)其表皮與部分真皮顏色變黑。ADSCs組的移植皮片在7 d時可見皮片少部分顏色變紅,質(zhì)地較軟。14 d時可見皮片周圍變黑,質(zhì)地較軟,切開皮片可見少部分表皮真皮變黑。ADSCs+MP的移植皮片在7 d時可見皮片上有點狀潮紅,無黑色壞死灶,質(zhì)地柔軟,切開皮片。14 d時可見皮片顏色部分變黑,質(zhì)地較軟,切開皮片可見表皮真皮部分變黑。21 d可見ASG組移植皮片部分脫落,創(chuàng)口中肉芽組織并未填充完全。MP組、ADSCs組、ADSCs+MP組皮片均完全變黑,質(zhì)地堅硬。

圖2 移植皮片表觀變化

2.2 移植皮片病理學(xué)分析

圖3顯示,7 d時ASG組可見其表皮脫落,表皮層與真皮層分離,真皮層出現(xiàn)大量空泡。14 d時皮膚結(jié)構(gòu)不可辨認(rèn),成均質(zhì)纖維化。7 d時MP組皮片角質(zhì)層增厚,有少量炎性細(xì)胞。14 d時可見表皮角質(zhì)層脫落,真皮中大量膠原纖維崩解并且由于壞死出現(xiàn)大面積空洞。7 d時ADSCs組與ADSCs+MP組有少量炎性細(xì)胞浸潤,14 d時可見ADSCs組與表皮角質(zhì)層增厚,有炎性細(xì)胞浸潤,ADSCs+MP組有少量炎性細(xì)胞浸潤。

圖3 皮膚組織病理變化

2.3 血常規(guī)以及血清球蛋白檢測

圖4可知,在7 d時WBC結(jié)果表明,ADSCs組相比于ASG組顯著下降(P<0.05),其他組無顯著性差異。14 d時ADSCs+MP組較ASG組顯著下降(P<0.05),其他組無顯著性差異。7 d時NEU結(jié)果顯示,MP組相較于ASG組顯著上升(P<0.05)。在14 d時ADSCs組與ADSCs+MP組相較于ASG組均極顯著降低(P<0.01)。LYM在7、14 d各組之間無顯著性差異。GLB在7 d時MP組、ADSCs組、ADSCs+MP組相較于ASG組均極顯著降低(P<0.01)。在14 d時MP組相較于ASG組顯著下降(P<0.05),其他組無顯著性差異。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01

2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測

圖5顯示,在7、14 d時,ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的GSH表達(dá)量極顯著高于ASG組與MP組。14 d時,ADSCs+MP組(P<0.05)的GSH的表達(dá)量顯著高于ADSCs組。在7 d時,ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的SOD表達(dá)量極顯著高于ASG組與MP組。MP組(P<0.05)的表達(dá)量顯著高于ASG組。14 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的SOD表達(dá)量極顯著高于ASG組。ADSCs+MP組(P<0.01)的SOD表達(dá)量極顯著高于MP組。MP組與ASG組無顯著性差異。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01;與MP組相比,##.P<0.01;與ADSCs組相比,+.P<0.05

2.5 CD4+T細(xì)胞免疫組化結(jié)果

圖6顯示,7 d時可見ADSCs組(P<0.05)與ADSCs+MP組(P<0.05)的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量顯著低于ASG組。MP組(P<0.01)CD4+T細(xì)胞數(shù)量極顯著低于ASG組。ADSCs組與ADSCs+MP組無顯著性差異。在14 d時可見MP組(P<0.05)、ADSCs組(P<0.05)、ADSCs+MP組(P<0.05)的CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著低于ASG組,ADSCs+MP組(P<0.05)顯著低于MP組。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01;與MP組相比,#.P<0.05

2.6 炎癥因子表達(dá)量檢測

圖7顯示,在7 d時IL-1β在ASG組的表達(dá)量均極顯著高于MP組(P<0.01)、ADSCs組(P<0.01)、ADSCs+MP組(P<0.01)。在14 d時,IL-1β在ASG組的表達(dá)量顯著高于MP組(P<0.05)、ADSCs組(P<0.05)、ADSCs+MP組(P<0.05)。MP、ADSCs、ADSCs+MP之間沒有顯著性差異。IL-6的表達(dá)量在7 d時ASG組顯著高于MP組(P<0.05)、ADSCs+MP組(P<0.05),極顯著高于ADSCs組(P<0.01)。在14 d時,IL-6 ASG組的表達(dá)量極顯著高于MP組(P<0.01)、ADSCs組(P<0.01)、ADSCs+MP組(P<0.01)。MP、ADSCs、ADSCs+MP之間沒有顯著性差異。TNF-α的表達(dá)量7 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)相對于ASG組極顯著下降,MP組相對于ASG組無顯著性差異。14 d時4組無顯著性差異。IL-2的表達(dá)量在7、14 d時相對于ASG組,ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)極顯著降低,MP組相對于ASG組無顯著性差異。IFN-γ的表達(dá)量在7、14 d時相對于ASG組,MP組(P<0.01)、ADSCs組(P<0.01)、ADSCs+MP組(P<0.01)極顯著下降。在7、14 d時,IL-4的表達(dá)量ADSCs+MP組(P<0.01)相對于ASG組極顯著升高。ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)IL-10的表達(dá)量相對于ASG組,ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)在7、14 d時極顯著上升。MP組相對于ASG組無顯著性差異。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01

2.7 炎癥因子上游蛋白NF-κB的表達(dá)量檢測

圖8顯示,在7、14 d時NF-κB的蛋白結(jié)果表明。ASG組P-NFκB的表達(dá)量顯著大于ADSCs組、ADSCs+MP組。在7 d時MP組(P<0.05)、ADSCs組(P<0.05)、ADSCs+MP組(P<0.05)的NF-κB基因表達(dá)量顯著低于ASG組,MP組、ADSCs組、ADSCs+MP組之間無顯著性差異。14 d時,ADSCs組(P<0.05)與ADSCs+MP組(P<0.05)的NF-κB基因表達(dá)量顯著低于ASG組,MP組與ASG組無顯著性差異。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01

2.8 創(chuàng)口愈合因子檢測

圖9表明,7 d時MP組TGF-β的表達(dá)量顯著低于ADSCs與ADSCs+MP組。但14 d時MP組與ADSCs組、ADSCs+MP組并未有顯著性差異。VEGF在7、14 d時ADSCs組、ADSCs+MP組的表達(dá)量顯著高于MP組。CXCR4在7 d的ADSCs組(P<0.01)、ADSCs+MP組(P<0.01)、MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著高于ASG組,ADSCs組(P<0.05)顯著高于MP組,ADSCs+MP組(P<0.01)極顯著高于MP組,ADSCs+MP組(P<0.05)顯著高于ADSCs組。CXCR4在14 d的ADSCs組(P<0.01)、ADSCs+MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著高于ASG組。MP組(P<0.05)的表達(dá)量顯著高于ASG組。SDF1在7、14 d時,ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)SDF1的表達(dá)量極顯著高于MP組,ADSCs組(P<0.01)極顯著高于ASG組。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01;與MP組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;與ADSCs組相比,+.P<0.05

2.9 創(chuàng)口生長因子上游通路檢測

圖10表明,在7、14 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)皮質(zhì)醇(cortisol)的表達(dá)量極顯著低于ASG組與MP組。在14 d時,ADSCs+MP組(P<0.05)顯著高于ADSCs組。14 d時免疫印跡結(jié)果表明,在7、14 d時ADSCs組與ADSCs+MP組的11β-HSD1顯著小于MP組,并且其11β-HSD2的表達(dá)量顯著大于MP組。P-AKT的表達(dá)中MP組顯著大于ADSCs組與ADSCs+MP組。在7、14 d時MP組PI3K的表達(dá)顯著高于ADSCs組與ADSCs+MP組。從基因表達(dá)量上分析:11β-HSD1在7 d時ADSCs組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著低于MP組,ADSCs+MP組(P<0.05)顯著低于MP組。14 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著低于MP組。11β-HSD2在7 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著高于MP組,MP組(P<0.01)與ADSCs組(P<0.01)極顯著低于ASG組,ADSCs+MP組(P<0.05)顯著低于ASG組,ADSCs+MP組(P<0.01)極顯著低于ADSCs組。14 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著高于ASG組與MP組。7 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的AKT的表達(dá)量極顯著低于MP組。14 d時,ADSCs組AKT的表達(dá)量極顯著(P<0.01)低于ASG組,顯著(P<0.05)低于MP組。ADSCs+MP組(P<0.05)AKT的表達(dá)量顯著低于ASG組。7 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)PI3K的表達(dá)量極顯著低于MP組,ADSCs+MP組(P<0.05)的表達(dá)量顯著低于ADSCs組。14 d時ADSCs組(P<0.01)與ADSCs+MP組(P<0.01)的表達(dá)量極顯著低于ASG組與MP組。

與ASG組相比,*.P<0.05,**.P<0.01;與MP組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;與ADSCs組相比,+.P<0.05,++.P<0.01

3 討 論

對于異體皮膚移植,移植皮片排斥反應(yīng)評估主要是依據(jù)kanitakis與banff 2007分級[15]。其中kanitakis分級主要是依據(jù)皮膚表觀變化。banff 2007分級主要依據(jù)病理學(xué)變化,如:炎癥浸潤、角質(zhì)層細(xì)胞狀態(tài)等進行病理分級(表2、3)。從皮膚表觀上分析,7 d時ASG組在Ⅲ～Ⅳ級,MP組在Ⅱ～Ⅲ級,ADSCs組與ADSCs+MP組在Ⅰ～Ⅱ級。14 d時ASG組與MP組為IV級,ADSCs組皮片黑色壞死部分在1/3～2/3,為Ⅲ～Ⅳ級、ADSCs+MP組在Ⅱ～Ⅲ級。21 d時4組皮片均為IV級。表明在21 d時4組皮片均已壞死。從病理學(xué)分析可見,在7 d時ASG組為Ⅲ～Ⅳ級,MP組在Ⅱ～Ⅲ級,ADSCs組與ADSCs+MP組為Ⅱ～Ⅲ級。14 d時ASG組與MP組為IV級,ADSCs組為Ⅲ～Ⅳ級,ADSCs+MP組為Ⅱ～Ⅲ級。綜合兩種分析評級方式可見在ASG組皮片存活時間為7 d左右,而MP組存活時間為7～14 d,ADSCs組與ADSCs+MP組存活時間則為14～21 d。這說明ADSCs+MP可以有效延長皮片存活時間。

表3 病理學(xué)分析移植皮片排斥分級

異體皮膚移植后,由于HLA的不完全匹配可能會導(dǎo)致移植物中的T淋巴細(xì)胞進入到受體體內(nèi),對受體造成全身性的炎癥反應(yīng)。本研究對受體小型豬血液進行血常規(guī)與血清生化進行檢測。結(jié)果表明,應(yīng)用ADSCs組與ADSCs+MP組可以顯著減少血液中中性粒細(xì)胞與球蛋白的含量。說明ADSCs+MP抑制由異體皮膚移植引發(fā)的全身性炎性反應(yīng)。

研究表明,導(dǎo)致異體移植皮片壞死的主要原因是供受體之間的免疫排斥反應(yīng)。在異體皮膚移植7 d時,移植皮片會與創(chuàng)口間組織粘連,并在創(chuàng)底與移植皮片之間會有相應(yīng)的肉芽組織再生與血管重建。但當(dāng)血供建立完成后,異體皮片中的樹突細(xì)胞會隨著血管進入到受體的次級淋巴結(jié)中,此時經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞的識別后會刺激CD4+與CD8+的大量分泌[16],并會大量分化TH1進而促進IL-2與IFN-γ等炎性因子的分泌[17-18]。導(dǎo)致7～14 d時在創(chuàng)底與異體移植皮片交界處產(chǎn)生大量炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致移植皮片壞死。結(jié)果表明,ADSCs+MP可以有效抑制CD4+T細(xì)胞。并且通過抑制炎癥因子上游蛋白NF-κB來抑制炎癥因子IL-2與IFN-γ的表達(dá),從而抑制免疫排斥反應(yīng)。

在傷口愈合炎癥期時,巨噬細(xì)胞根據(jù)愈合過程的階段表達(dá)不同的表型和活動。促炎巨噬細(xì)胞在早期被招募到傷口區(qū)域。它們表達(dá)TNF-α、IL1β、IL-6等促炎因子以殺死病原體,在抗炎反應(yīng)后期時抗炎巨噬細(xì)胞會被召集到創(chuàng)口處抑制炎癥的發(fā)展,并促進肉芽組織填充。但甲潑尼龍大量使用時,會顯著延長傷口的炎癥期,并抑制血管的重建與肉芽組織的再生。從而導(dǎo)致傷口愈合緩慢[19-20]。本研究表明,相對于MP組,ADSCs+MP可以顯著促進抗炎巨噬細(xì)胞分泌IL-10、IL-4,并且抑制促炎巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α。使創(chuàng)傷快速渡過炎癥反應(yīng)期,達(dá)到促進創(chuàng)口組織再生的目的。

VEGF可以激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成芽。此外,VEGF還參與了血管形成、傷口愈合和器官再生[21]。但糖皮質(zhì)激素會通過抑制VEGF達(dá)到抑制血管再生的目的[22]。本研究結(jié)果表明,相對于MP組,ADSCs+MP組可以顯著提高VEGF、SDF-1、CXCR4的表達(dá)。這證明ADSCs具有逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抑制血管生成和遷移的作用。除此之外,TGF-β具有抑制CD4+T細(xì)胞、抑制IL-2等炎性因子表達(dá)并增強肉芽組織再生等的功能[23-24],本試驗結(jié)果表明甲潑尼龍可以抑制TGF-β的表達(dá),但在ADSCs+MP中可顯著促進TGF-β的表達(dá)。說明ADSCs+MP可通過促進VEGF、TGF-β等生長因子的分泌來促進創(chuàng)口愈合。

在表皮真皮中存在11β-HSD1能將可的松轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇發(fā)揮出抗炎的作用[25]。而當(dāng)皮膚皮質(zhì)醇表達(dá)過量時會導(dǎo)致延長皮膚創(chuàng)口愈合炎癥反應(yīng)期,抑制創(chuàng)口肉芽組織再生與血管重建[26-27]。當(dāng)注射大量外源性糖皮質(zhì)激素時,可以通過11β-HSD1的大量表達(dá)來促進皮質(zhì)醇的升高[28],進而危害皮膚創(chuàng)口愈合。但這種升高可以被ADSCs所逆轉(zhuǎn)。這證明ADSCs可以通過抑制11β-HSD1、促進11β-HSD2的表達(dá)來抑制皮膚皮質(zhì)醇的含量,進而促進皮膚愈合。研究表明,外源性給予糖皮質(zhì)激素時會導(dǎo)致機體PI3K/AKT的水平升高[29],并且當(dāng)PI3K被抑制時,11β-HSD1也會被抑制[30]。本試驗結(jié)果表明,ADSCs可以逆轉(zhuǎn)由甲潑尼龍引起的PI3K高表達(dá)。由此研究表明ADSCs有可能是通過PI3K/AKT通路來影響11β-HSD1的表達(dá),進而達(dá)到抑制皮質(zhì)醇表達(dá)的目的。

4 結(jié) 論

1)ADSCs+MP組相對于ASG組,有效延長皮片存活時間至14～21 d。并為以后更換組織工程皮等創(chuàng)造更有利的條件與時間。2)ADSCs+MP通過影響NF-κB的表達(dá)抑制IL-2、INF-γ等炎性因子的表達(dá)抑制免疫排斥反應(yīng)。3)相較于ASG組,ADSCs+MP通過促進VEGF、TGF-β、SDF-1等愈合因子的表達(dá),進而促進創(chuàng)口愈合。4)ADSCs可以通過PI3K/AKT通路影響11β-HSD1的表達(dá),起到抑制皮脂醇增多的作用。