細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲circRNA差異表達(dá)分析

王正榮,馬 勛,張艷艷,孫 艷,孟季蒙,薄新文,*

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832000;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,石河子 832000;3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832000)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,E.granulosus)屬于扁形動(dòng)物門,絳蟲綱,圓葉目,帶科,棘球?qū)傥锓N,是囊型包蟲病的主要病原[1]。該病呈世界性分布,我國是囊型包蟲病的高發(fā)國家之一。全國20多個(gè)省份均有該病發(fā)生,主要流行于青海、西藏、新疆、四川等畜牧業(yè)較發(fā)達(dá)的地區(qū)。據(jù)估計(jì),我國包蟲病患者人數(shù)約為100萬,受威脅人口近6 600萬。與現(xiàn)有的全球包蟲病流行數(shù)據(jù)相比,中國包蟲病受威脅人口數(shù)和患者人數(shù)仍居世界首位[1-2]。該病已嚴(yán)重威脅到廣大農(nóng)牧區(qū)群眾的生命健康和財(cái)產(chǎn)安全,是導(dǎo)致我國西部農(nóng)牧區(qū)群眾因病致貧、因病返貧的主要病因之一。該病已被納入“健康中國2030”規(guī)劃中的五大寄生蟲病,同時(shí)也是我國免費(fèi)救治的重大傳染病之一[3]。

細(xì)粒棘球絳蟲的成蟲寄生于犬科動(dòng)物的小腸,成熟的蟲卵和孕卵節(jié)片隨糞便排出體外,污染草場和水源,被中間宿主牛、羊、駱駝等誤食,蟲卵在胃腸液的刺激下發(fā)育為六鉤蚴,六鉤蚴鉆過腸壁,隨血液循環(huán)到達(dá)宿主全身各處,形成包囊,里面含有大量原頭蚴,其中主要以肝包囊為主。如宿主體內(nèi)的包囊因機(jī)械損傷而破裂,每個(gè)原頭蚴又可以發(fā)育為新的包囊。終末宿主犬科動(dòng)物因采食被感染的含有包囊的動(dòng)物臟器而感染,包囊中的原頭蚴在終末宿主小腸內(nèi)經(jīng)大約45 d發(fā)育為成熟的蟲體。其中,細(xì)粒棘球絳蟲的原頭蚴是蟲體生長發(fā)育的主要階段,在中間宿主體內(nèi)可以經(jīng)無性生殖發(fā)育為新的包囊,在終末宿主體內(nèi)可以經(jīng)過有性生殖發(fā)育為成蟲,進(jìn)而產(chǎn)生具有感染性的蟲卵。同時(shí)原頭蚴也是細(xì)粒棘球絳蟲感染宿主的主要階段,既可以在中間宿主造成二次感染形成新的包囊,也可以感染終末宿主,發(fā)育為成蟲,進(jìn)而形成新的循環(huán)[4-5]。由此可見,原頭蚴無論是在蟲體的生長發(fā)育,還是感染過程中都發(fā)揮著重要作用。但目前對(duì)其發(fā)育調(diào)控機(jī)制還知之甚少。近年的研究發(fā)現(xiàn),circRNA是一種重要的非編碼RNA調(diào)控分子。該分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),可通過結(jié)合miRNA,作為翻譯模板,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,與RNA結(jié)合蛋白作用等,在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上等多種水平調(diào)控基因表達(dá)[6-7]。目前,有關(guān)circRNA分子在細(xì)粒棘球絳蟲生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能的研究鮮有報(bào)道。基于此,本研究擬采用RNA-seq技術(shù)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴,成蟲以及包囊壁中circRNA表達(dá)譜特性進(jìn)行系統(tǒng)解析,篩選各階段高表達(dá)以及特異表達(dá)circRNA分子,對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測,進(jìn)而為進(jìn)一步研究其在蟲體生長發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及主要儀器

在石河子牛羊屠宰場收集被細(xì)粒棘球絳蟲感染的帶有包囊的羊肝3個(gè),4 ℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室,無菌條件下抽取含有原頭蚴的包囊液,3 000 r·min-1離心5 min收集原頭蚴,分離包囊壁,用加有1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的PBS洗滌3～5次,最后將收集的原頭蚴、包囊壁保存至-80 ℃冰柜備用。細(xì)粒棘球絳蟲成蟲全蟲樣品為本實(shí)驗(yàn)室前期-80 ℃冰柜保存樣品,采自人工感染犬。細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲的分子鑒定按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

胎牛血清購自公司Gibco公司(美國);RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自Sigma公司(美國);小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自ATCC細(xì)胞庫(中國);SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing試劑盒購自Clontech公司(美國);AMPure XP beads試劑盒購自Beckman公司(美國);Invitrogen TRIzol Reagent購自Invitrogen公司(美國);CW2582 cDNA合成試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司(中國);SYBR PremixExTaqMix購自TaKaRa公司(日本);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Lightcycle 2.0購自羅氏公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及質(zhì)控 準(zhǔn)備足量樣品,按照TRIzol試劑盒提取樣品總RNA,提取后使用微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)檢測OD260 nm/OD280 nm值以鑒定RNA樣品濃度,排除RNA污染可能性。Bioanalyzer 2100(Agilent,Santa Clara,CA)用于評(píng)估總RNA質(zhì)量,以RIN≥7且260/280≥1.8為閾值,RNase-free DNase I (Ambion Inc.,Texas,USA)用于消除潛在的基因組DNA污染。分離的RNA樣本保存在-80 ℃環(huán)境下。

1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建和RNA測序 RNA質(zhì)檢合格后,分別從3個(gè)發(fā)育階段樣品中各取出約10 μg RNA,分別構(gòu)建測序文庫,主要包括酶促RNA片段化、cDNA合成、測序接頭銜接及PCR擴(kuò)增等過程。首先,根據(jù)EpicentreRibo-Zero Gold 試劑盒(Illumina,San Diego,USA)的操作說明,消耗樣品中的核糖體RNA、線性RNA并純化后,在高溫下使其片段化,隨后轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫,最后分別利用 Illumina Hiseq 4000進(jìn)行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及轉(zhuǎn)錄水平分析 采用Cutadapt軟件對(duì)測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾[9],除去低質(zhì)量、含N的序列后,通過Bowtie2軟件[10]和Tophat2軟件[11]將clean reads比對(duì)到細(xì)粒棘球絳蟲的基因組(GenBank登錄號(hào)NW_020170381.1)。通過StringTie[12]軟件識(shí)別新的轉(zhuǎn)錄本,并在此基礎(chǔ)上采用Ballgown[13]軟件估計(jì)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。進(jìn)行基因表達(dá)定量前,先通過FPKM算法消除偏好性。在本研究中,采用edgeR軟件包確定差異表達(dá)基因[14],同時(shí)使用上四分位數(shù)算法校正數(shù)據(jù),即設(shè)定|log2(兩個(gè)樣本的 FPKM 比率)|≥1且P≤0.05為閾值。采用TopHat-fusion[15]和CIRCExplorer2[16]軟件對(duì)未映射序列進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過反向剪接讀數(shù)來估計(jì)circRNA的表達(dá)水平[17],通過Pearson相關(guān)系數(shù)R2值估算確定circRNA及其相應(yīng)親本基因的共表達(dá)關(guān)系。本研究采用TMeV軟件對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行熱圖繪制,直觀展示各樣本的表達(dá)一般規(guī)律、差別及變化,從而通過聚類預(yù)測新型circRNA的功能及作用。circRNA-miRNA互作分析主要采用Targetscan與miRanda軟件進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測后取交集,將得到的數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape繪制可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 差異表達(dá)circRNA的GO及KEGG通路富集分析 經(jīng)定量確定的差異表達(dá)circRNA仍需深入了解其生物學(xué)功能進(jìn)而發(fā)掘重要的調(diào)控因子,在生物信息學(xué)分析中,常采用基因本體論(gene ontology,GO)進(jìn)行分析[18]。在GO體系中,可以依次從細(xì)胞成分、生物學(xué)過程和分子功能3個(gè)方面定位基因功能,使用其注釋富集功能將具有相似注釋的轉(zhuǎn)錄物整合歸類。在預(yù)測各類未知circRNA時(shí),除了通過circRNA的宿主基因進(jìn)行功能預(yù)測外,后期還可間接通過它們在生物信號(hào)通路中的參與情況進(jìn)行功能分析。生物通路富集分析主要依賴于京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫[19],其中途徑富集分析可以精確定位差異表達(dá)基因的主要代謝轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本研究使用Scripts in house軟件進(jìn)行GO(http:∥geneontology.org)和KEGG(http:∥www.kegg.jp/kegg)富集分析,設(shè)置統(tǒng)計(jì)P≤0.05為結(jié)果顯著閾值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 為確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性,需要通過qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)水平。經(jīng)過組間對(duì)比和篩選,最終選擇4個(gè)circRNAs分子進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄物引物(表1),使用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Lightcycle 2.0進(jìn)行定量PCR。試驗(yàn)結(jié)果用采用2-ΔΔ Ct法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[20],利用SPSS 22.0軟件對(duì)所得表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),結(jié)果分為差異顯著(P≤0.05)和差異極顯著(P≤0.01)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)相關(guān)引物

2 結(jié) 果

2.1 RNA-seq 數(shù)據(jù)分析

采用RNA-Seq和Small RNA-Seq深度測序,成蟲每個(gè)樣本文庫內(nèi)獲得約90 000 000的原始數(shù)據(jù),質(zhì)量控制后平均得到約90 000 000的有效讀段;包囊壁每個(gè)樣本文庫內(nèi)獲得約92 000 000的原始數(shù)據(jù),質(zhì)量控制后平均得到約90 000 000的有效讀段;原頭蚴每個(gè)樣本文庫內(nèi)獲得約86 000 000的原始數(shù)據(jù),質(zhì)量控制后平均得到約86 000 000的有效讀段。Q-score>20的reads在99%以上,Q-score>30的reads在97%。綜上,充分證明樣本數(shù)據(jù)處理得當(dāng),質(zhì)量可靠,符合下游數(shù)據(jù)分析要求。在深度分析樣本注釋結(jié)果,評(píng)估細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段中轉(zhuǎn)錄本豐度及表達(dá)差異情況前,計(jì)算評(píng)估了各生物學(xué)重復(fù)間皮爾森積矩相關(guān)系數(shù)平方(R2)均大于0.98,均滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

經(jīng)篩選鑒定,最終鑒定得到635個(gè)circRNAs分子,其中有573個(gè)屬于外顯子來源的circRNAs分子,有14個(gè)屬于內(nèi)含子來源的circRNAs分子,有48個(gè)屬于外顯子-內(nèi)含子circRNAs分子。對(duì)獲得的circRNA分子的堿基組成分析發(fā)現(xiàn),來源于成蟲的circRNA分子,其GC為58.88%,來源于包囊壁的circRNA分子,其GC為60.09%,而來源于原頭蚴的circRNA分子,其GC為59.74%。對(duì)circRNA分子的長度分析發(fā)現(xiàn),成蟲的crcRNA分子,其平均長度為2 100 nt左右,最長為17 013 nt,最小為191 nt;原頭蚴的circRNA分子,其平均長度為1 560 nt左右,最長為20 176 nt,最小為179 nt;包囊壁的其平均長度為1 580 nt左右,最長為20 176 nt,最小為179 nt。

2.2 差異表達(dá)circRNA的鑒定

在細(xì)粒棘球絳蟲的3個(gè)不同發(fā)育階段,共鑒定635個(gè)circRNAs分子,利用FPKM算法標(biāo)準(zhǔn)化基因轉(zhuǎn)錄水平差異,以細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴為參照,和成蟲相比,有74個(gè)差異表達(dá)的circRNAs分子,其中上調(diào)表達(dá)的有68個(gè),下調(diào)表達(dá)的有6個(gè)(圖1a);和包囊壁相比,有64個(gè)差異表達(dá)的circRNAs分子,其中上調(diào)表達(dá)的有55個(gè),下調(diào)表達(dá)的有9個(gè)(圖1b);成蟲和包囊壁相比,有45個(gè)差異表達(dá)的circ-RNAs分子,其中上調(diào)表達(dá)有1個(gè),下調(diào)表達(dá)的有44個(gè)(圖1c);圖1 d顯示了circRNA分子在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲差異表達(dá)的熱圖分析結(jié)果。其中在原頭蚴階段特異表達(dá)的circRNA有44個(gè),包括novel_circ_0000037、novel_circ_0000254、novel_circ_0000307、novel_circ_0000379、novel_circ_0000501、novel_circ_0000537、novel_circ_0000704、novel_circ_0000855、novel_circ_0001062、novel_circ_0001105、novel_circ_0001221、novel_circ_0001250、novel_circ_0001375、novel_circ_0001424、novel_circ_0001490、novel_circ_0001554、novel_circ_0001585、novel_circ_0001781、novel_circ_0001932、novel_circ_0002021、novel_circ_0002060、novel_circ_0002101、novel_circ_0002298、novel_circ_0002332、novel_circ_0002371、novel_circ_0002391、novel_circ_0002416、novel_circ_0002509、novel_circ_0002635、novel_circ_0002713、novel_circ_0002843、novel_circ_0002909、novel_circ_0003207、novel_circ_0003410、novel_circ_0003417、novel_circ_0003436、novel_circ_0003558、novel_circ_0003815、novel_circ_0003867、novel_circ_0003978、novel_circ_0003986、novel_circ_0004074、novel_circ_0004131和novel_circ_0004185;包囊壁特異表達(dá)的circRNA分子有2個(gè),為novel_circ_0002919和novel_circ_0003163;成蟲階段未發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)的circRNA分子。

以原頭蚴為參照,分別和包囊壁以及成蟲相比,其特異性差異表達(dá)的circRNA分子數(shù)量分別為58和68個(gè),共同差異表達(dá)的circRNAs分子為6個(gè),分別為novel_circ_0000017、novel_circ_0000654、novel_circ_0002024、novel_circ_0002781、novel_circ_0003640和novel_circ_0004249(圖2a)。以包囊壁為參照,分別和原頭蚴以及成蟲相比,其特異性差異表達(dá)的circRNA分子分別為60和41個(gè),共同差異表達(dá)的circRNA分子為4個(gè),分別為novel_circ_0002781、novel_circ_0003060、novel_circ_0003061和novel_circ_00032370(圖2b)。

進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴階段高表達(dá)top10的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345、novel_circ_0002695、novel_circ_0000126、novel_circ_0004249、novel_circ_0003763、novel_circ_0001419和novel_circ_0004199。在成蟲階段高表達(dá)top10的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0001343、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345、novel_circ_0001341、novel_circ_0000582、novel_circ_0002695、novel_circ_0000126和novel_circ_0002031。在原頭蚴和成蟲兩個(gè)階段均高表達(dá)的circRNA分子包括novel_circ_0003572、novel_circ_0003080、novel_circ_0002505、novel_circ_0003345和novel_circ_0002695。在包囊壁階段高表達(dá)top10的circRNA分子包括novel_circ_0000654、novel_circ_0002781、novel_circ_0003237、novel_circ_0003060、novel_circ_0003061、novel_circ_0004249、novel_circ_0002463、novel_circ_0002024、novel_circ_0003163和novel_circ_0002278。

2.3 差異表達(dá)circRNA的GO分析

GO分析結(jié)果顯示,原頭蚴和成蟲相比,差異表達(dá)的CircRNA的顯著富集于75個(gè)條目,包括14個(gè)分子功能條目,22個(gè)細(xì)胞組分條目,39個(gè)生物學(xué)過程條目。主要富集于分子功能的核苷酸酶活性、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性和FDA結(jié)合等;細(xì)胞組分的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞以及細(xì)胞部分等;生物學(xué)過程的多細(xì)胞生物的生殖、單細(xì)胞生物的生殖、氰酸酯代謝、有性生殖、精子發(fā)生、雄性配子產(chǎn)生、軸系發(fā)生以及神經(jīng)生成、分化等(圖3)。原頭蚴成包囊壁相比,差異表達(dá)的circRNA的顯著富集于55個(gè)條目,包括34個(gè)生物學(xué)過程條目,12個(gè)細(xì)胞組分條目,9個(gè)分子功能條目。主要富集于生物學(xué)過程的脂質(zhì)定位、氰酸酯代謝過程、調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積以及細(xì)胞壁大分子分解代謝過程等;細(xì)胞組分的固有的細(xì)胞器膜、細(xì)胞器膜組成部分、固有的高爾基膜以及高爾基膜組成部分等。分子功能的酰輔酶A脫氫酶活性、溶菌酶活性、ADP結(jié)合以及結(jié)構(gòu)分子活性等(圖4)。成蟲和包囊壁相比,差異表達(dá)的差異表達(dá)的CircRNA的顯著富集于65個(gè)條目,包括18個(gè)分子功能條目,14個(gè)細(xì)胞組分條目,33個(gè)生物學(xué)過程條目。主要富集于分子功能的FDA結(jié)合、二甲基丙酸錫脫硫甲基酶活性和6-磷酸果糖激酶活性等;細(xì)胞組分的病毒膜、細(xì)胞前緣及細(xì)胞色素b6f蛋白復(fù)合體等;生物學(xué)過程的磷酸烯醇式丙酮酸依賴性糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、碳水化合物運(yùn)輸、精子發(fā)生、雄性配子產(chǎn)生、軸系發(fā)生以及神經(jīng)生成、分化等(圖5)。

圖3 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲差異表達(dá)circRNA分子的GO功能分析

圖4 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和包囊壁差異表達(dá)circRNA分子的GO功能分析

2.4 差異表達(dá)circRNA的KEGG分析

KEGG分析結(jié)果顯示,原頭蚴和包囊壁相比,差異表達(dá)的circRNA的顯著富集于背腹軸形成、Notch、wnt以及FoxO信號(hào)通路等(圖6a)。原頭蚴和成蟲相比,差異表達(dá)的circRNA的顯著富集于Notch、三羧酸循環(huán)、磷脂酰肌醇、核黃素代謝通路以及脂肪酸合成和降解等信號(hào)通路。成蟲和包囊壁相比,差異表達(dá)的circRNA的顯著富集于Notch、碳代謝、三羧酸循環(huán)以及糖酵解/糖異生通路。圖6b顯示了差異表達(dá)的circRNA在Notch信號(hào)通路的富集情況,圖6c顯示了circRNA在背腹軸形成信號(hào)通路的富集結(jié)果。

a.原頭蚴和包囊壁中差異表達(dá)circRNA的KEGG信號(hào)通路顯著富集結(jié)果;b.差異表達(dá)circRNA在NOTCH信號(hào)通路的富集結(jié)果;c.差異表達(dá)circRNA在DORSO-VENTRAL AXIS FORMATION(Grk/Egfr)信號(hào)通路的富集結(jié)果

2.5 circRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的差異表達(dá)circRNA及其靶向的miRNA和mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。原頭蚴和成蟲相比,有33個(gè)差異表達(dá)的circRNAs與24個(gè)miRNAs以及108個(gè)mRNAs構(gòu)成302個(gè)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中24個(gè)差異表達(dá)circRNAs和其互作的14個(gè)miRNAs、55個(gè)mRNAs形成164個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)符合circRNA上調(diào)表達(dá),miRNA下調(diào)表達(dá),mRNA下調(diào)表達(dá)的規(guī)律(圖7)。原頭蚴和包囊壁相比,有2個(gè)差異表達(dá)的circRNAs與1個(gè)miRNA以及1個(gè)mRNA構(gòu)成2個(gè)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。成蟲和包囊壁相比,有16個(gè)差異表達(dá)的circRNAs與10個(gè)miRNAs以及37個(gè)mRNAs構(gòu)成73個(gè)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中有13個(gè)差異表達(dá)的circRNAs與7個(gè)miRNAs以及16個(gè)mRNAs構(gòu)成36個(gè)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖8)。

圖7 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲差異表達(dá)circRNA分子上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)型circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控通路分析

圖8 細(xì)粒棘球絳蟲成蟲和包囊壁差異表達(dá)circRNA分子下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)型circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控通路分析

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量檢測

為驗(yàn)證從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中獲得差異基因結(jié)果的可靠性,隨機(jī)選取4個(gè)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,其中包括novel_circ_0003572、novel_circ_0002024、novel_circ_0003223和novel_circ_0003080,結(jié)果顯示qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果一致,進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可信(圖9)。

圖9 差異表達(dá)circRNA的qRT-PCR驗(yàn)證分析

3 討 論

環(huán)狀RNA(CircRNAs)是一類不具有5′端帽子和3′端ploy(A)尾巴結(jié)構(gòu)的共價(jià)閉合環(huán)狀RNA分子[21-22]。早在1976年,Sanger等[23]就在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了CircRNA。隨后的幾十年間,科學(xué)家又相繼在小鼠、猴、豬、人等物種中發(fā)現(xiàn)了circRNA[24-27]。由于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法對(duì)circRNA數(shù)量和豐度的檢測能效都非常有限,因此一直以來circRNA被認(rèn)為是RNA異常剪接的產(chǎn)物。近年來隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展和高通量測序技術(shù)的不斷革新,目前已經(jīng)在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大量內(nèi)源circRNAs,大部分circRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,豐度高且呈現(xiàn)出時(shí)空表達(dá)特異性,說明circRNA可能在調(diào)控基因表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用[21,28]。根據(jù)序列構(gòu)成的差異可以將circRNA分為3類:外顯子circRNA (exonic circRNA,ecRNA),內(nèi)含子circRNA(circular intronic RNA,ciRNA),外顯子-內(nèi)含子circRNA (exon-intron circRNA,Elci-RNA)[29-31]。這些circRNA具有自身特有的產(chǎn)生方式,同時(shí)它們的生物學(xué)功能也有一定差異。與其他非編碼RNA一樣,circRNA的序列和結(jié)構(gòu)決定了它的生物學(xué)功能。circRNA可能通過以下幾種方式發(fā)揮生物學(xué)功能:miRNA海綿,作為翻譯模板,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,與RNA結(jié)合蛋白作用[32-34]。

目前有關(guān)寄生蟲circRNA的研究報(bào)道相對(duì)較少。Broadbent 等[35]研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲有數(shù)百個(gè)circRNA分子,并對(duì)其中部分分子進(jìn)行了初步驗(yàn)證。Zhou 等[36]測序分析發(fā)現(xiàn)circRNA分子在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3期幼蟲、成熟雌蟲和雄蟲中存在差異表達(dá),且其功能主要與機(jī)體代謝、MAPK信號(hào)通路以及磷脂酰肌醇信號(hào)通路相關(guān)。同時(shí)也有部分學(xué)者對(duì)宿主應(yīng)對(duì)寄生蟲感染時(shí)宿主circRNA分子的差異表達(dá)進(jìn)行了研究,挖掘出一些與宿主應(yīng)對(duì)寄生蟲感染相關(guān)的circRNA分子[37-39]。近年來,也有棘球絳蟲circRNA相關(guān)的研究報(bào)道,但多數(shù)研究者把研究的焦點(diǎn)放在宿主方面,如Kalifu 等[40]研究發(fā)現(xiàn),和正常肝組織相比,患者包囊組織中有177個(gè)ccircRNAs分子的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),166個(gè)出現(xiàn)下調(diào)。基因功能聚類分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的circRNA分子可能參與有機(jī)化合物循環(huán)、內(nèi)源性刺激以及細(xì)胞生物過程等。之后,Liu等[41]研究發(fā)現(xiàn),在多房棘球絳蟲感染的小鼠肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝枯否細(xì)胞中共鑒定到6 290個(gè)circRNAs分子,進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)在多房棘球絳蟲感染后2和3個(gè)月的時(shí)候,小鼠肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝枯否細(xì)胞中分別有834個(gè)、834個(gè)以及760個(gè)差異表達(dá)的circRNA分子。目前,僅有1篇有關(guān)細(xì)粒棘球絳蟲蟲體本身circRNA相關(guān)的研究報(bào)道,此研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與包囊液外泌體中分別有1 277和512個(gè)circRNAs分子,其中有183個(gè)circRNAs分子是二者共有的[42]。由以上研究可以發(fā)現(xiàn),目前對(duì)棘球絳蟲circRNA的研究,基本還是停留在組學(xué)測序分析階段,有關(guān)其具體生物學(xué)功能的研究還未見報(bào)道。同時(shí),有關(guān)系統(tǒng)解析細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段,即原頭蚴,成蟲以及包囊壁相關(guān)circRNA的研究亦未見報(bào)道。基于此,為了揭示circRNA分子在細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段的差異表達(dá)以及發(fā)生的分子事件,本研究采用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)解析了circRNA分子在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴,成蟲以及包囊壁中的表達(dá)譜特性,篩選了各階段高表達(dá)以及特異表達(dá)circRNA分子,并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了預(yù)測,為進(jìn)一步揭示這些差異表達(dá)的circRNA分子在蟲體生長發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

本研究的結(jié)果顯示,circRNA在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁和成蟲的表達(dá)均存在差異。同時(shí),本研究首次在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和包囊壁中分別鑒定到44和2個(gè)特異表達(dá)的circRNA分子,推測其在蟲體原頭蚴和包囊壁的發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用。對(duì)差異表達(dá)circRNA分子的GO分析結(jié)果顯示,當(dāng)成蟲和原頭蚴、包囊壁相比,部分差異表達(dá)的circRNA分子的功能顯著富集于有性生殖、精子發(fā)生、雄性配子產(chǎn)生、軸系發(fā)生以及神經(jīng)生成、分化等過程。這一結(jié)果和細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)育規(guī)律恰好吻合,相對(duì)于蟲體原頭蚴和包囊壁,成蟲是蟲體有性生殖、精子發(fā)生和雄性配子產(chǎn)生的主要階段,也是蟲體前后軸發(fā)育,神經(jīng)生成、分化的主要階段[43],此結(jié)果提示這些差異表達(dá)的circRNA分子可能參與調(diào)控了細(xì)粒棘球絳蟲以上的生物學(xué)過程。對(duì)差異表達(dá)circRNA分子的KEGG分析結(jié)果顯示,原頭蚴和包囊壁相比,差異表達(dá)的circRNA顯著富集于背腹軸形成和Notch信號(hào)通路。

本研究對(duì)差異表達(dá)circRNA進(jìn)行ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),有164個(gè)ircRNA-miRNA-mRNA調(diào)控通路屬于up-down-up的調(diào)控形式,有36個(gè)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控通路屬于down-up-down的調(diào)控形式。同時(shí),分析發(fā)現(xiàn)有8個(gè)編碼基因既參與up-down-up調(diào)控通路,又參與down-up-down調(diào)控通路,包括thymidine kinase、ccaat enhancer binding protein beta、caspase 8、THUMP domain containing protein 1、ETS transcription factor Elf 2、SH2、tetraspanin和Heat shock 70 kDa protein 4。其中ccaat enhancer binding protein beta是一種神經(jīng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控蛋白,已有研究顯示此蛋白在成年嚙齒動(dòng)物大腦的不同部位表達(dá)[44-45]。在突觸可塑性和記憶形成中發(fā)揮重要作用,尤其是在海馬體[46-47]、神經(jīng)元分化[48-49]和海馬神經(jīng)原的發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用[50],與其互作的miRNA為egr-miR-10227a-5p,circRNA為novel_circ_0000152。而SH2是一種精子發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因,具體參與調(diào)控精子核的形狀[51],與其互作的miRNA為novel_19,circRNA分別為novel_circ_0002024、novel_circ_0003572、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419。

在up-down-up的調(diào)控通路中,還有1個(gè)參與調(diào)控雄性生殖細(xì)胞生長發(fā)育相關(guān)的基因,即Tesmin TSO1 CXC,此基因在雄性配子的發(fā)育以及精子的分化過程中起到調(diào)控作用[52],與其互作的miRNA為egr-miR-4990,circRNA分別為novel_circ_0002152、novel_circ_0000017、novel_circ_0002024、novel_circ_0000654、novel_circ_0000253和novel_circ_0003999。Tetraspanin是一類四跨膜蛋白,此家族成員在絳蟲基因組中發(fā)生擴(kuò)張[53],并且可能是宿主/病原體微界面的主要成分,同時(shí)也是絳蟲釋放到宿主體內(nèi)外泌體的主要組成部分[54],此類蛋白可以結(jié)合宿主抗體的Fc區(qū)域[55],并且其本身具有很高的免疫原性[56],與其互作的miRNA為novel_19,circRNA為novel_circ_0002024、novel_circ_0003572、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419。對(duì)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn),novel_circ_0003572既在蟲體原頭蚴和成蟲階段高表達(dá),又可能參與調(diào)控蟲體雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育以及蟲體的免疫調(diào)控等過程,提示其可能具有重要的生物學(xué)功能,可以作為后續(xù)深入研究的一個(gè)靶標(biāo)。除此之外,還發(fā)現(xiàn)novel_circ_0002024、novel_circ_0003223和novel_circ_0001419同樣也參與調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過程,提示這些分子也可能在細(xì)粒棘球絳蟲的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能,但其具體的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述,本研究首次系統(tǒng)解析了circRNA在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴、包囊壁以及成蟲的差異表達(dá)譜特性。篩選了細(xì)粒棘球絳蟲各發(fā)育階段高表達(dá)以及特異表達(dá)的circRNA分子,并且初步預(yù)測了蟲體精子生長發(fā)育以及蟲體神經(jīng)生成、分化相關(guān)的circRNA分子及其circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控通路,為進(jìn)一步闡明circRNA分子在細(xì)粒棘球絳蟲生長發(fā)育中的作用提供了新的視角。