基于小鼠模型研究腸道菌群紊亂對BVDV易感性的影響

黃 江,李 闖,崔月琦,袁雪瑩,趙志誠,劉 宇,2,周玉龍,2,朱戰波,2*,張澤財,2*

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院,大慶 163319;2.黑龍江省牛病防控工程技術研究中心,大慶 163319)

牛病毒性腹瀉-黏膜病(BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的牛的一種重要傳染病。BVDV感染可導致牛的急性感染,表現為發熱、腹瀉、黏膜潰瘍、繁殖障礙等,嚴重威脅養牛業健康發展。持續性感染和免疫抑制也是BVDV感染的兩個重要特點,為該病的凈化增加了難度,同時增加了繼發感染的風險,造成的間接經濟損失也不容忽視[1-3]。目前,尚沒有治療該病的特效藥物,疫苗接種仍然是主要的防控手段,但由于毒株具有種類多、易變異、感染率高等特點,導致該病防控效果較差。在注重疫苗研發的同時,深入探究與BVDV感染可能相關的因素,對該病的防控也許有重要價值。

腸道菌群是機體內數量龐大的微生物群體,在宿主的消化、免疫調節中發揮關鍵作用[4-5]。然而,當動物受到飼料轉換、生產、抗生素長期使用、環境變化等應激因素影響時,容易導致正常菌群組成發生變化,造成菌群紊亂[6-9]。大量研究表明,腸道菌群與多種疾病的發生密切相關,如炎癥性腸病和腸易激綜合征等腸道內疾病[10-11],以及心血管疾病和神經退行性疾病等腸道外疾病[12-13]。近年,越來越多的研究也報道,腸道菌群與多種感染性疾病的發生發展密切相關,且腸道菌群紊亂可降低機體免疫應答能力,進而增加病原的易感性[14]。依據臨床上多種因素容易導致腸道菌群發生紊亂,結合腸道菌群紊亂可降低機體對病原的清除能力,推測腸道內定居的微生物也許是導致BVDV高感染率的一個關鍵因素。因此,本研究擬通過建立抗生素誘導的腸道菌群紊亂小鼠模型,探究腸道菌群紊亂對BVDV易感性的影響,為揭示臨床BVDV高感染率以及為該病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒株和實驗動物

CP型BVDV(NADL株)由黑龍江省牛病防控工程技術研究中心保存,SPF級BALB/c雌性小鼠36只(6～8周齡),購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑

硫酸新霉素、氨芐青霉素、甲硝唑均購自上海慧穎科技有限公司;鹽酸萬古霉素購自浙江醫藥股份有限公司;兩性霉素B購自浙江海正藥業股份有限公司;山羊抗兔IgG/辣根酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒、SYBR熒光定量qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。TRIzol購自Invitrogen公司。

1.3 動物分組與處理

菌群紊亂小鼠模型構建:依據前期研究報道[15],具體方法如下:將6只BALB/c小鼠隨機分為2組,分別為抗生素處理組(Abx group)和健康對照組(Control group),每組3只。Abx組小鼠依據體重,按照100 mg·kg-1氨芐西林、50 mg·kg-1鹽酸萬古霉素、100 mg·kg-1甲硝唑、100 mg·kg-1硫酸新霉素、1 mg·kg-1兩性霉素B的劑量,每日2次,連續灌胃13 d后,收集小鼠糞便樣本,進行菌群結構分析。對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

BVDV感染小鼠模型構建:將菌群紊亂小鼠和健康小鼠平均各分為2組,分別為Control組、BVDV組、Abx-BVDV組和Abx組,每組5只。依據課題組前期建立的方法[16],BVDV感染組小鼠腹腔注射105TCID50的CP型BVDV,Control組和Abx組小鼠接種等體積的DMEM,于感染第7天,采集小鼠血液和十二指腸用于各項指標檢測。

糞菌移植(FMT)試驗:試驗分為Abx-BVDV組和Abx-BVDV-FMT組,每組5只。抗生素處理13 d后,依據前期研究報道的方法對Abx-BVDV-FMT組小鼠進行FMT試驗[17-18],Abx-BVDV組小鼠給予等體積的生理鹽水,FMT共處理9 d。即:于移植第3天,腹腔注射BVDV,在BVDV感染期間每天移植1次。BVDV感染7 d后,采集小鼠血液和十二指腸用于各項指標檢測。所有試驗均獲得黑龍江八一農墾大學動物倫理委員會批準。

1.4 16 S rRNA 測序

取菌群紊亂小鼠模型構建試驗中Control組和Abx組小鼠的糞便樣本,采用SDS法提取菌群DNA,并檢測其濃度和純度。對V3-V4區進行擴增,通過Hi Seq2500 PE250進行測序分析。利用Uparse軟件將同源性高于97%的序列聚類為同一OTUs,并依據OTU對樣本進行物種分類注釋。組間差異選用R 軟件分析,α多樣性和β多樣性指數反應。兩組間比較采用T-test和wilcox檢驗。

1.5 熒光定量PCR檢測小鼠血液和十二指腸中BVDV載量

無菌取BVDV感染小鼠模型構建試驗和FMT試驗中各組小鼠血液和十二指腸(n=5),采用TRIzol法提取總RNA,并反轉錄為cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應。BVDV引物序列為,上游:5′-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3′,下游:5′-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3′,引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。反應體系:SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL,水7 μL,上、下游引物各1 μL,目的模板1 μL,共20 μL體系。反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共45個循環,根據標準曲線計算出病毒載量。

1.6 Western blot檢測小鼠十二指腸中BVDV E0蛋白表達

無菌取BVDV感染小鼠模型構建試驗和FMT試驗中各組小鼠十二指腸(n=5),加入組織裂解液,提取蛋白。每孔上樣40 μg,50V恒壓電泳25 min、80V恒壓電泳20 min,然后120V恒壓電泳45 min。切下目的凝膠轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1.5 h后,分別加入鼠源BVDV E0(1∶100)一抗和兔源a-tubulin(1∶3 000)一抗,4 ℃孵育過夜。鼠源和兔源二抗(1∶8000),室溫孵育2 h,使用ECL顯色劑進行顯色,于凝膠成像儀中進行曝光成像,得到灰度值,計算相對表達量。

1.7 十二指腸病理組織學檢查

無菌取BVDV感染小鼠模型構建試驗和FMT試驗中各組小鼠十二指腸(n=5),部分組織于10%甲醛中固定,7 d后取出組織,并經沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片等步驟,完成組織切片的制備。

1.8 統計分析

數據采用SPSS 25.0統計學軟件處理。計量資料用“均數±標準差(mean±SD)表示”,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P>0.05差異不顯著,P<0.05和P<0.01認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 抗生素處理對小鼠腸道菌群結構和豐度的影響

所有樣品測序共獲得480 083對Reads,雙端Reads質控、拼接后共產生478 700條Clean Reads,平均產生79 783條Clean Reads。對α多樣性指數分析發現,與對照組相比,抗生素處理顯著減少了ACE、Chao1、Simpson和Shannon指數水平(圖1A～D)。在Control組和Abx組間共存在218個共有的OTUs。與α多樣性指數變化相同的是,Control組中存在205個特異的OTUs,而Abx組中僅有7個(圖1E)。β多樣性(PCoA和UPGMA法聚類)分析結果表明,Control組和Abx組樣本中微生物組成存在差異(圖2A、B)。進一步對物種門水平分析發現,厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是相對豐度最高的三個門水平物種(圖2C)。與Control組相比,抗生素處理顯著降低了厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度,然而顯著增加了變形菌門相對豐度(圖2C～E)。

A.ACE指數;B.Chao 1指數;C.Simpsion 指數;D.Shannon 指數;E.Venn 圖。**.P<0.01,下同

A.PCoA 分析;B.UPGMA聚類樹與柱狀圖結合;C.門水平上微生物相對豐度;D.厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度;E.變形菌門相對豐度

2.2 腸道菌群紊亂對BVDV復制的影響

如圖3A、3B所示,與BVDV組相比,腸道菌群紊亂明顯增加了小鼠血液和十二指腸中BVDV RNA水平。Western blot檢測也發現,腸道菌群紊亂小鼠十二指腸中BVDV E0蛋白表達顯著高于BVDV感染的健康小鼠(圖3C、3D)。

A.血液中BVDV RNA水平;B.十二指腸中BVDV RNA水平;C.十二指腸中BVDV E0蛋白水平;D.BVDV E0蛋白灰度分析

2.3 腸道菌群紊亂對小鼠十二指腸病理變化的影響

對BVDV感染7 d的小鼠十二指腸進行病理組織學檢測發現,與Control組相比,BVDV感染導致十二指腸整體結構輕度異常,上皮細胞脫落壞死、少量炎癥細胞浸潤。然而,與BVDV感染的健康小鼠相比,BVDV感染的腸道菌群紊亂組小鼠的十二指腸病理學變化更為顯著(圖4)。

2.4 糞菌移植(FMT)對BVDV感染小鼠的保護作用

如圖5所示,與Abx-BVDV組相比,在FMT移植給菌群紊亂小鼠后,血液和十二指腸中BVDV RNA水平均被顯著抑制(圖5A、5B)。與Abx-BVDV組相比,FMT處理也顯著降低了BVDV E0蛋白的表達(圖5C、5D)。病理組織學分析發現,BVDV感染菌群紊亂小鼠誘導的十二指腸整體結構異常、上皮細胞脫落壞死以及炎性細胞浸潤,在FMT處理后明顯改善(圖5E)。

A.血液中BVDV RNA水平;B.十二指腸中BVDV RNA水平;C.十二指腸中BVDV E0蛋白水平;D.BVDV E0蛋白灰度分析;E.十二指腸病理變化 (HE染色 200×)

3 討 論

腸道菌群是動物體內數量龐大、種類繁多的微生物群體,與機體的健康息息相關。本研究以抗生素誘導的腸道菌群紊亂小鼠模型為研究對象,探究了腸道菌群紊亂對BVDV感染的影響。對腸道菌群紊亂的重要指標進行檢測發現,在抗生素處理13 d后,小鼠腸道內微生物的ACE、Chao1、Simpson和Shannon等α多樣性指數均明顯下降,表明抗生素處理減少了腸道微生物的多樣性。OTU是為了便于分析,人為劃分的分類單元,1個OTU通常代表1個微生物物種。本研究中,抗生素處理也減少了OTU的數量,進一步表明抗生素具有降低微生物多樣性的能力。微生物組成是評估腸道菌群紊亂的另一個重要指標。前期研究表明,抗生素誘導的腸道菌群紊亂小鼠中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度明顯降低,然而變形菌門相對豐度卻顯著增加[19-20]。本研究首先通過微生物β-多樣性分析發現,抗生素處理組和對照組小鼠腸道微生物可明顯區分開,表明兩組間存在顯著的微生物群落差異。隨后,在門水平上進一步分析了微生物組成的不同,發現厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是相對豐度最高的3種。與前期研究結果相一致的是,抗生素處理組中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度明顯降低,變形菌門相對豐度顯著增加。以上結果表明,抗生素誘導的腸道菌群紊亂小鼠模型被成功建立。

生產實踐中,由于疾病治療中抗生素的長期使用、飼料的轉換、生產以及各類應激因素均易導致動物正常腸道微生物組成發生改變,造成菌群紊亂。近年,越來越多的研究也表明腸道菌群與感染性疾病的發生發展密切相關。如,Abt等[21]研究發現,紊亂的腸道菌群可通過抑制機體先天性免疫反應和獲得性免疫反應,降低機體對流感病毒的清除能力。另外,有研究也證實腸道菌群紊亂可加重肺炎球菌和鉤端螺旋體的感染[18,22]。重要的是,Thackrag等[23]發現,紊亂的腸道菌群可誘導CD8+T數量減少,同時增加與BVDV同科的西尼羅河病毒、登革熱病毒和寨卡病毒對小鼠的易感性。本團隊前期研究已經證實,BVDV感染小鼠的外周血淋巴細胞中CD8+T數量顯著減少,通過干預CD8+T增殖和活化具有抗BVDV效果[24-25]。另外,參與BVDV致病過程中的多種分子機制,也受腸道菌群的調節,如先天性免疫、自噬等[26-27]。基于上述理論,筆者推測紊亂的腸道菌群也許將影響BVDV的感染。與該理論假設相一致的是,本研究發現在BVDV感染的腸道菌群紊亂小鼠的血液和十二指腸中BVDV載量要明顯高于BVDV感染的健康小鼠,十二指腸病理學變化也進一步證實了腸道菌群紊亂能夠增加BVDV的易感性。已有研究證實,采用干預腸道菌群的方微生態制劑等干預腸道菌群的策略是否具有抗BVDV效果,本研究進行了糞菌移植(FMT)試驗。FMT試驗是研究腸道微生物與疾病相關性的常用方法,同時也在疾病治療中呈現較好效果[28-30]。本研究通過給菌群紊亂小鼠回補健康供體小鼠腸道微生物后,發現通過微生物恢復的方法可以對BVDV感染的小鼠起到較好的保護效果。這些結果進一步表明,腸道菌群也許是影響BVDV感染的重要因素之一。

4 結 論

本研究成功構建了腸道菌群紊亂小鼠模型,證實了小鼠腸道菌群紊亂具有增加BVDV易感性的作用,初步揭示了以腸道菌群為靶點的微生態制劑和抗BVDV藥物的研發也許具有一定的可行性。然而,小鼠和本體動物間腸道菌群結構存在一定的差異,腸道菌群對BVDV感染本體動物的影響及其分子機制仍有待進一步研究。