犬子宮蓄膿組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

鐘 華,宋杉杉,邵浣婷,趙 瑜,康勁文,吳 瑤,蘇仁偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642)

犬子宮蓄膿是一種犬常見(jiàn)的在子宮腔內(nèi)積聚膿液并伴有子宮內(nèi)膜異常增生的疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),子宮蓄膿可以在25%的成年雌性犬科動(dòng)物中發(fā)生[1]。如不及時(shí)治療,可能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,包括膿毒癥、感染性休克、腹膜炎和多器官功能障礙[1],并有致命的危險(xiǎn)。子宮蓄膿的病因較為復(fù)雜,許多因素包括年齡、細(xì)菌感染、激素水平和生殖生理都是其發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[2]。其中,最常從子宮蓄膿中分離出的病原體是大腸桿菌[3-4]。

然而,盡管進(jìn)行了廣泛的研究,目前仍未完全了解子宮蓄膿的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制。因此,子宮蓄膿缺乏治愈性的非手術(shù)療法,最有效的治療方法是卵巢子宮切除術(shù),但仍會(huì)導(dǎo)致3%～4%的術(shù)后死亡[5-6]。此外,因?yàn)樵缙谧訉m蓄膿的癥狀十分輕微,寵主難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)、獸醫(yī)難以及時(shí)進(jìn)行診斷,在沒(méi)有干預(yù)和治療的情況下,隨著病情的發(fā)展,子宮蓄膿有危及生命的可能。因此,快速、早期的診斷和有效的干預(yù)在臨床實(shí)踐中具有非常高的價(jià)值,為該病尋找可靠的生物標(biāo)記物是一項(xiàng)重要而迫切的任務(wù),而子宮蓄膿特異性上調(diào)基因及其相關(guān)產(chǎn)物是潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

近年來(lái),隨著新一代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已被廣泛用于分子機(jī)制的研究。與微陣列相比,RNA-seq是一種具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度的測(cè)序技術(shù),且不會(huì)受到交叉雜交和非特異性雜交的影響[7]。本研究通過(guò)RNA-seq,分析蓄膿犬子宮中的轉(zhuǎn)錄組水平變化,篩選差異表達(dá)基因、調(diào)控通路以及中樞基因,為了解子宮蓄膿的分子機(jī)制提供寶貴資源。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和樣本采集

對(duì)經(jīng)超聲診斷為子宮蓄膿的犬只,記錄臨床資料,包括名字或登記證號(hào)、品種、性別、絕育情況、最后發(fā)情時(shí)間、發(fā)病時(shí)間、年齡、體重、是否開(kāi)放型子宮蓄膿、有無(wú)膿液流出等基本情況。在征得寵物主人的同意并去除膿液后,立即進(jìn)行拍照記錄。先用PBS洗滌組織,洗去表面的血液和宮內(nèi)膿液,然后去除子宮系膜。將組織切成大約5 mm3的立方體。所有收集的子宮樣本在液氮中快速冷凍或在4% PFA中固定并儲(chǔ)存在-80 ℃。所有動(dòng)物樣本均來(lái)自廣州奈谷動(dòng)物醫(yī)院和廣州福懋動(dòng)物醫(yī)院。一共收集了19只患犬的組織,包括10只子宮蓄膿犬和9只健康犬。

1.2 基因文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

利用TRIzol RNA試劑(TaKaRa,大連,中國(guó))從組織中提取總 RNA。使用 ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation(諾禾致源生物信息技術(shù),北京,中國(guó))評(píng)估總RNA的純度和完整性具有以下質(zhì)量控制參數(shù):A260/A280>1.8,A260/A230>2.0,RNA完整性≥8.0。cDNA文庫(kù)由TruSeq RNA樣品制備試劑盒(Illumina,圣地亞哥,加利福尼亞州,美國(guó))生成。使用 Illumina HiSeqTM2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq。

1.3 RNA-Seq和數(shù)據(jù)分析

RNA-seq 生成的原始數(shù)據(jù)首先用Fast-QC做質(zhì)量評(píng)估,刪除3′端測(cè)序接頭序列和低質(zhì)量(質(zhì)量低于20個(gè)堿基)的堿基。利用Tophat v1.4.0將干凈讀數(shù)序列與參考基因組EnsemblCanFam進(jìn)行比對(duì),用Cufflinks v1.3.0分析差異表達(dá)基因。原始數(shù)據(jù)保存在Gene Expression Omnibus (GEO)中,登錄號(hào)為GSE208124。以log2FC>2和FDR<0.05選擇差異表達(dá)的基因。

1.4 GO、KEGG和網(wǎng)絡(luò)分析

利用DAVID工具進(jìn)行GO term富集分析[8]。調(diào)整后的P值(Benjamini-Hochberg多重檢驗(yàn)校正方法)的cut-off值設(shè)為0.01。Wordcloud R包用于生成顯著富集的GO條目詞云。每個(gè)富集的GO條目詞云中的字體大小與-lg(P-adj)成正比。DAVID工具也用于通路富集分析,并采用與GO分析相同的cut-off值。用蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING)v10.0于創(chuàng)建基因網(wǎng)絡(luò)[9],最低綜合得分設(shè)置為0.900(最高置信度)。用Cytoscape軟件進(jìn)行基因網(wǎng)絡(luò)的可視化和分析,用Network Analyzer 分析每個(gè)基因的連通性[10],關(guān)鍵中樞基因的連通閾值為平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 免疫組織化學(xué)(IHC)

石蠟切片(5 μm)用于免疫組織化學(xué)染色。在脫蠟和復(fù)水后,加入pH 6.0的檸檬酸鈉溶液中在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù),用3%過(guò)氧化氫封閉15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,一抗在4℃孵育過(guò)夜,之后與HRP的二抗(ORIGENE,北京,中國(guó))在37℃孵育1 h,再用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(ORIGENE,北京,中國(guó))顯色并用蘇木精復(fù)染,最后將組織切片脫水封片。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證犬子宮蓄膿差異表達(dá)基因的測(cè)序結(jié)果,選擇CDK1、CDC6、PRKCB、PIEZO1、PRKCD、YWHAG、ESR1、ACTB基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。根據(jù)NCBI中犬(Canislupusfamiliaris)的參考序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,GAPDH作為參考基因以標(biāo)準(zhǔn)化靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。使用TRIzol試劑(TaKaRa)提取RNA,用HiSuperscript II試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用 SYBR 方法進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算,使用Graph Pad Prism 8.0 軟件展開(kāi)表達(dá)量分析。

表1 qRT-PCR引物

1.7 組織化學(xué)評(píng)分(H-SCORE)

使用圖像分析軟件Image J 對(duì)ER α的免疫組化染色進(jìn)行H-SCORE分析,如文獻(xiàn)所述[11-12]。

(3)企業(yè)加大與高校聯(lián)合，為大學(xué)生學(xué)習(xí)創(chuàng)業(yè)知識(shí)提供廣闊的舞臺(tái)。不管是我國(guó)早就提倡的產(chǎn)學(xué)研合作，還是以協(xié)同創(chuàng)新中心為重要載體的教育部“高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃”都離不開(kāi)高校與企業(yè)的合作，更離不開(kāi)企業(yè)的參與，通過(guò)企業(yè)與高校合作，大學(xué)生可以到實(shí)踐基地、合作企業(yè)去兼職，去實(shí)習(xí)，去工作，在這些過(guò)程中獲得企業(yè)創(chuàng)立運(yùn)營(yíng)的“真知識(shí)”，再結(jié)合大學(xué)生在學(xué)校的理論知識(shí)，就可以為創(chuàng)業(yè)提供強(qiáng)大的智力支持和動(dòng)力保證。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用雙尾student-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并由GraphPad Prism 8.0(GraphPad 軟件)執(zhí)行。數(shù)據(jù)顯示為“平均值±SEM”。P<0.05被認(rèn)為差異是顯著的。

2 結(jié) 果

2.1 犬子宮蓄膿的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的鑒定

為全面了解患有子宮蓄膿犬的基因表達(dá)變化,分別從患子宮蓄膿犬和健康犬子宮取材進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,利用 Tophat和 Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)與差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)子宮蓄膿與健康犬的差異表達(dá)基因(DEGs)11 812個(gè),其中上調(diào)7 086個(gè),下調(diào)4 726個(gè)(圖1A、1B)。

A.子宮蓄膿和健康狗差異基因表達(dá)變化的火山圖。藍(lán)色為未改變的基因,紅色表示上調(diào)基因,綠色表示下調(diào)基因。B.差異表達(dá)基因的聚類熱圖。Pyo.患子宮蓄膿犬;Nom.健康犬。下同

2.2 GO 功能注釋的差異性分析和 KEGG-pathway差異性分析

進(jìn)一步探索 DEGs在子宮蓄膿和健康犬的子宮中的功能差異,進(jìn)行了GO和KEGG分析。富集的GO術(shù)語(yǔ)分為生物過(guò)程 (Biological Process,BP)、細(xì)胞成分 (Cell Component,CC) 和分子功能 (Molecular Function,MF)(圖2A)。在BP類別中,有15個(gè)顯著富集的條目,其中包括G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)、生物調(diào)節(jié)、生物過(guò)程調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、對(duì)刺激的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)、趨化性、趨向性等。富集的 MF 類別是跨膜信號(hào)受體活性、信號(hào)受體活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、金屬肽酶活性、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、DNA 連接酶 (NAD+)活性、蛋白激酶活性。有趣的是,在所有排名靠前的富集GO術(shù)語(yǔ)中,來(lái)自BP的免疫系統(tǒng)過(guò)程和趨化性,以及來(lái)自MF的細(xì)胞因子活性、趨化因子活性及其受體結(jié)合均反映了子宮蓄膿過(guò)程中的炎癥和免疫反應(yīng)。此外,圖2B顯示了豐富的KEGG通路,其中大量通路參與炎癥反應(yīng),包括NF-κB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、吞噬體和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

2.3 差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)

基因網(wǎng)絡(luò)是使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)生成的。將綜合得分設(shè)置為0.9,獲得了一個(gè)由132個(gè)節(jié)點(diǎn)組成的基因網(wǎng)絡(luò),這些節(jié)點(diǎn)通過(guò)275條邊連接(圖3A)。拓?fù)浞治霰砻?該基因網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)(圖3B),網(wǎng)絡(luò)中有一些節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相比高度連接。這些高度連接的節(jié)點(diǎn),也稱為中樞基因,代表網(wǎng)絡(luò)中的重要基因,一共確定了22個(gè)中樞基因(圖3C)。值得注意的是,CDK1、ESR1、SHC1、ACTG1、PRKCB、CCNA2、LYN、AKT1、KIF23、PRKCD和CDC6 的連接數(shù)超過(guò)了平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,因此這 11 個(gè)基因可以被認(rèn)為是這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵中樞基因。

2.4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證犬子宮蓄膿差異表達(dá)基因的測(cè)序結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)參基因,選擇CDK1、CDC6、PRKCB、PIEZO1、PRKCD、YWHAG、ESR1、ACTB進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq的結(jié)果趨勢(shì)一致。

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

2.5 免疫學(xué)結(jié)果證實(shí)犬子宮蓄膿中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)

為了驗(yàn)證 GO和 KEGG 分析,用免疫組織化學(xué)的方法對(duì) ERα、NF-κB 和 uNK 進(jìn)行染色。ERα是一種由性激素雌激素激活的核受體[13],染色結(jié)果證實(shí),ERα在犬子宮蓄膿的間質(zhì)和腺上皮中的表達(dá)均降低(圖5A、5B)。同時(shí),確認(rèn)NF-κB在健康犬子宮中的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),而在發(fā)生炎癥時(shí)其易位至細(xì)胞核表達(dá),該結(jié)果與先前研究結(jié)果一致[14](圖5C)。在小鼠和人類上,子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK)被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)胚胎植入和成功妊娠的關(guān)鍵[15],而目前對(duì)犬uNK細(xì)胞的發(fā)育及功能的研究仍不及其在人類與小鼠中的研究。本研究的染色結(jié)果顯示 uNK細(xì)胞在子宮蓄膿犬中的表達(dá)增加(圖5D)。

3 討 論

子宮蓄膿為發(fā)生于母犬的一種損傷生殖系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的慢性或急性常見(jiàn)病,某些犬種中10歲以下有50%以上的母犬都會(huì)受其影響[5]。因此,確定用于診斷子宮蓄膿的分子標(biāo)記具有重要意義,而犬子宮蓄膿時(shí)表達(dá)增加的基因產(chǎn)物是非常好的選擇。以往的研究表明,蓄膿犬血清中多種免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子增加,如IL-6、CRP、TNF-α等[16]。然而,少有試驗(yàn)研究子宮蓄膿犬子宮內(nèi)的基因表達(dá)情況。在本研究中,應(yīng)用了具有高精確度和靈敏度的RNA-seq來(lái)識(shí)別受子宮蓄膿影響時(shí)犬子宮轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的差異,一共發(fā)現(xiàn)了11 812個(gè)基因差異表達(dá),其中7 086個(gè)基因在蓄膿子宮中上調(diào),而4 726個(gè)基因下調(diào)。更重要的是,上調(diào)基因的模式反映了免疫和炎癥反應(yīng),如與免疫和炎癥系統(tǒng)過(guò)程相關(guān)的幾個(gè)基因和通路的表達(dá)均上調(diào),包括但不限于 NF-κB信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、吞噬體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等。

GO和 KEGG-Pathway分析表明,免疫反應(yīng)激活是犬子宮蓄膿的主要病理階段。GO分析表明,免疫系統(tǒng)過(guò)程和趨化性的活性增加,包括細(xì)胞因子和趨化因子活性的分子功能,以及細(xì)胞因子受體結(jié)合和趨化因子受體結(jié)合。細(xì)胞因子幾乎涉及免疫和炎癥的各個(gè)方面,包括抗原呈遞、細(xì)胞募集、激活、黏附分子表達(dá)等[17]。先前的研究報(bào)道,在大于94%的子宮蓄膿犬血清樣本中檢測(cè)到了IL-7、IL-8、IL-15、IL-18和TNF-α,與對(duì)照組相比,在患有子宮蓄膿的犬血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)濃度更高,且與血清內(nèi)IL-15濃度相關(guān),同時(shí),在由子宮蓄膿引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征的犬中檢測(cè)到更高的血清IL-7濃度[16]。在另一項(xiàng)研究中,與其他母犬相比,在患有子宮蓄膿的母犬中檢測(cè)到的更高水平的 IL-4,并且與處于發(fā)情期和妊娠期的母犬相比,患有子宮蓄膿的母犬血清中IL-10 顯著增加[4]。這表明幾種細(xì)胞因子在子宮蓄膿疾病發(fā)展中的作用以及診斷犬子宮蓄膿的可能價(jià)值。同時(shí),本研究也顯示趨化因子在蓄膿子宮中的激活,趨化因子是一組能夠在各種細(xì)胞中誘導(dǎo)趨化作用的小分子,這些分子通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)活性[17],其誘導(dǎo)的趨化性功能在本研究的GO分析結(jié)果中也顯示為上調(diào)。與本研究一致,此前的研究在患有子宮蓄膿的犬的血清中檢測(cè)到明顯更高濃度的角質(zhì)細(xì)胞衍生趨化因子(KC),并且 KC 濃度與住院天數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)量、IL-8濃度以及帶狀中性粒細(xì)胞占比顯著相關(guān)[18]。這些研究都表明需要進(jìn)一步研究免疫細(xì)胞因子作為診斷犬子宮蓄膿生物標(biāo)志物的可能性。

本研究中KEGG-Pathway分析顯示,與健康犬科動(dòng)物相比,患有子宮蓄膿的犬科動(dòng)物子宮中自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有所增加。細(xì)胞毒性是免疫系統(tǒng)對(duì)抗感染的重要效應(yīng)機(jī)制,在大多數(shù)情況下,細(xì)菌感染后免疫細(xì)胞衍生大量對(duì)抗感染的細(xì)胞因子,進(jìn)一步活化NK細(xì)胞[19],也有越來(lái)越多的研究表明NK細(xì)胞通過(guò)直接識(shí)別細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物而被激活[20]。而在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),uNK 細(xì)胞只有在妊娠時(shí)會(huì)持續(xù)存在,組織駐留自然殺傷細(xì)胞和循環(huán)自然殺傷細(xì)胞被認(rèn)為在懷孕期間有助于uNK細(xì)胞群的形成[21]。研究表明,uNK 分泌的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲促進(jìn)細(xì)胞因子(IL-8 和 IP-10)和重塑母體脊髓動(dòng)脈所需的各種血管生成因子,對(duì)于支持妊娠后期胎盤的充分灌注有非常重要作用,而其細(xì)胞毒性較差[15,22]。目前,在犬中對(duì) uNK細(xì)胞的發(fā)育和功能的研究遠(yuǎn)不及人類和小鼠。本研究免疫組化結(jié)果顯示,與健康犬科動(dòng)物相比,子宮蓄膿犬子宮中 uNK細(xì)胞表達(dá)增加。對(duì)于 uNK細(xì)胞在犬科動(dòng)物中的功能仍需要進(jìn)一步研究。

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了一個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由通過(guò)275條邊連接的132個(gè)節(jié)點(diǎn)組成,并在該網(wǎng)絡(luò)中,確定了11個(gè)關(guān)鍵中樞基因。由于中心基因在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置,它們可能比其他基因更為重要。這11個(gè)關(guān)鍵中樞基因分別是ESR1(Estrogen Receptor 1),CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1),SHC1(SHC Adapter Protein 1),ACTG1(Actin Gamma 1),PRKCD(Protein Kinase C Delta),CCNA2(Cyclin A2),LYN(LYN Proto-Oncogene),AKT1(AKT Serine/Threonine Kinase 1),KIF23(Kinesin Family Member 23),PRKCB(Protein Kinase C Beta)和CDC6(Cell Division Cycle 6)。

已有多項(xiàng)研究表明 ESR1對(duì)于免疫反應(yīng)基因的表達(dá)具有不一致的作用。研究表明,在紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中ESR1 促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,以響應(yīng)樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的 TLR 配體刺激[23-25]。相反,在其他幾種感染性疾病模型中,高水平的雌二醇和雌三醇恰恰會(huì)降低促炎性免疫反應(yīng)[26-28]。本研究結(jié)果與后者一致,觀察到ESR1 在患有子宮蓄膿的犬科動(dòng)物中的下調(diào)表達(dá)伴隨著促炎性免疫反應(yīng)的增加。雌激素差異改變ER活性以影響免疫反應(yīng)基因表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。一種可能性是,低水平或高水平的雌二醇會(huì)誘導(dǎo)不同的含 ER 的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,從而導(dǎo)致促進(jìn)或抑制炎癥的功能通路中基因的不同模式的表觀遺傳標(biāo)記[25]。同時(shí)研究表明,ERα參與NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,在許多情況下對(duì)ER和NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用[29],ERs對(duì) NF-κB通路的抑制通常會(huì)限制炎癥反應(yīng)的程度[30]。本研究觀察到在患有子宮蓄膿的犬科動(dòng)物中ESR1的表達(dá)下調(diào)以及 NF-κB的富集。迄今為止,關(guān)于NF-κB在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用的研究較多。作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫功能的多個(gè)方面[31-32]。它誘導(dǎo)各種促炎基因的表達(dá),包括編碼細(xì)胞因子和趨化因子的基因,而在本研究中也發(fā)現(xiàn)了這些基因的富集。由于失調(diào)的 NF-κB激活與炎癥性疾病有關(guān),因此靶向 NF-κB信號(hào)通路可能是子宮蓄膿抗炎治療的一種有力的方法。

此外,本研究GO分析還揭示了金屬內(nèi)肽酶和金屬肽酶的活性富集。與此前的一項(xiàng)微陣列研究一致,許多基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 成員在蓄膿犬子宮中上調(diào),包括膠原酶 MMP-1 和MMP-13,以及明膠酶MMP-9 和 MMP-7/基質(zhì)溶素[33]。其他的研究也類似地在子宮蓄膿中證實(shí)了編碼 MMP 的基因轉(zhuǎn)錄增加[34]。

由于收集的子宮樣本由復(fù)雜的細(xì)胞類型組成,本研究存在一定局限性。子宮壁由子宮內(nèi)膜、子宮肌層和子宮外膜三層構(gòu)成,而子宮外膜和子宮肌層厚度的差異可能會(huì)淡化子宮內(nèi)膜基因表達(dá)的變化。之前的研究利用酶分離的方法對(duì)子宮腔上皮進(jìn)行微陣列分析[35],這種方法的缺點(diǎn)在于酶分離細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組可能發(fā)生變化。也有研究使用激光捕獲顯微切割 (LCM) 從小鼠子宮中分離管腔上皮[36]。迄今,RNA-seq 技術(shù)的進(jìn)步已使得研究單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組成為可能[37],毫無(wú)疑問(wèn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用將為子宮轉(zhuǎn)錄組提供更好的分辨率。然而,與 LCM 一樣,靈敏度的妥協(xié)是目前這種方法的限制因素[38]。

目前,本研究下一步擴(kuò)展應(yīng)評(píng)估是否有任何已識(shí)別的上調(diào)基因可以用作疾病的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。此外,對(duì)于鑒定的基因產(chǎn)物是否與子宮細(xì)菌感染特異性相關(guān)、其上調(diào)是否是細(xì)菌損傷的一般結(jié)果仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

運(yùn)用 RNA-seq探索了子宮蓄膿犬和健康犬的全面基因表達(dá)譜,鑒定出11 812個(gè)差異表達(dá)基因,其中7 086個(gè)基因在患犬的子宮中上調(diào),4 726個(gè)基因下調(diào)。GO功能分析顯示,差異表達(dá)基因主要涉及免疫系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過(guò)程。KEGG-Pathway分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因參與炎癥與免疫反應(yīng)激活的信號(hào)通路,例如NF-κB 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、吞噬體和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,說(shuō)明炎癥和免疫反應(yīng)激活是犬子宮蓄膿的主要病理階段。通過(guò)使用 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)絡(luò),確定了11個(gè)關(guān)鍵中樞基因,其產(chǎn)物可能作為診斷子宮蓄膿的分子標(biāo)記。本研究為深入了解犬子宮蓄膿的機(jī)制提供了寶貴的資源。